抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体库的构建

目的 构建抗人血管生长素基因工程抗体文库。方法 采用ＰＣＲ等分子生物学手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体变可区重、轻链基因，通过噬菌体表面呈现技术表达抗体。结果 １获取了抗人血管生长素抗体可变区基因片段（ＳｃＦｖ），２得到了抗人血管生长素基因工程抗体文库。结论 本研究建立了一种构建高效抗人血管生长素抗文库的方法，该抗体库在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景。     

人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定

目的：建立人破伤风免疫噬菌体抗体库，筛选抗破伤风类毒素的抗体基因，并在大肠杆菌中表达可溶性Fab段。方法：从破伤风类毒素免疫志愿者中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，用一组人IgG Fab基因特异性引物，从合成的cDNA中经PCR扩增出抗体轻链(VL CL)和重链Fd(VH CHl)基因，分别经Xba Ⅰ／Sac Ⅰ和Spe Ⅰ／XhoⅠ酶切克隆入噬菌粒pComb3。用破伤风外毒素作为抗原进行筛选富集获得特异性抗破伤风类毒素的噬菌体抗体，切去噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ(gⅢ)，表达可溶性人抗破伤风类毒素的Fab段。结果：经核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人IgGFab基因；用ELISA鉴定表明，表达的人IgGFab抗体能特异性地与破伤风外毒素结合。结论：利用噬菌体抗体库技术筛选可得到与破伤风外毒素特异性结合的人抗破伤风类毒素基因工程抗体。     

基因工程技术制备和鉴定抗TNF-α蛋白Fab抗体

目的 利用基因工程技术制备人源性抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白的可溶性Fab抗体,并鉴定其抗原结合活性及特异性.方法 用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性.结果 成功筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体.ELISA筛选出2株抗体(TA-04,TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应.结论 成功表达并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体,构建了一种基因工程抗体的有效制备途径.为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础.     

人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定

目的:制备人源性抗核抗体Fab片段.方法:通过4轮淘筛,富集已构建的人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab片段噬菌体抗体;提取阳性克隆的噬菌粒DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue,以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段;应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达上清进行鉴定.结果:第4轮洗脱的噬菌体滴度较第1轮增加200条倍,从抗核抗体Fab片段噬菌体库中筛选出2株阳性克隆,切除gⅢ基因后自连的噬菌粒DNA经XhoⅠ单酶切证实连接成功.间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性抗核抗体Fab片段均呈现抗dsDNA阳性,具有抗原特异性;免疫荧光法结果显示:Hep2细胞和猴肝脏组织细胞核显示均质型荧光,绿蝇短膜虫的动基体显示均质型荧光.结论:成功制备具有抗原特异性的可溶性、人源性抗核抗体Fab片段,为高亲和力抗核抗体Fab片段的制备奠定了基础.     

抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定

目的：构建抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库．方法：利用噬菌体表面呈现技术，构建基因文库，经过ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集后，用ＥＬＩＳＡ方法检测抗原结合活性．结果：从９４个单个噬菌体克隆中一次筛选到１８个具有抗原结合活性的阳性克隆．结论：我们所应用的方法为抗肿瘤基因工程抗体的制备提供了一条更为有效的新途径，同时为今后胃癌显像诊断和治疗的基础及临床研究奠定了基础     

抗rhANG多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗重组人血管生长素(recombinant human angiogenin，rhANG)多克隆抗体，并初步应用于消化道肿瘤实验研究。方法 用重组基因工程菌表达，SDS法纯化的rhANG蛋白免疫新西兰兔，制备并纯化多克隆抗体，并用免疫组织化学和ELISA等方法对多克隆抗体进行测定。结果 此次获得的抗血清ELISA方法效价达1：12800，检测ANG灵敏度最低为8～16μg／L，不与其他细胞因子和血清反应。该抗体与20％～30％消化道恶性肿瘤呈阳性反应。结论 ANG多克隆抗体对表达ANG的肿瘤组织反应特异性强，ELISA方法检测灵敏度高，该抗体可用于ANG的检测。     

从噬菌体抗体库中筛选D二聚体特异的Fab抗体

目的:从人源性噬菌体抗体库中筛选抗人D二聚体单克隆抗体并进行可溶性表达。方法:以人D二聚体标准品为抗原对所构建的噬菌体抗体库进行两轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,从中筛选出抗人D二聚体的噬菌体Fab抗体,并在大肠杆菌细胞中进行可溶性表达。结果:经4次电转化构建了库容为2. 8×108cfu的抗体库,滴度为4. 1×1014PFU/mL,Fab基因重组率为46%。经过淘筛后携带抗人D二聚体抗体的特异性噬菌体得到了明显的富集。用试剂盒以ELISA法检测对人D二聚体的结合活性,得到抗人D二聚体单克隆抗体。筛选出的阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达筛选出的阳性克隆在大肠杆菌细胞中可溶性表达。结论:人D二聚体标准品对抗体库的淘筛,富集了表面呈现抗人D二聚体的单克隆抗体的噬菌体,成功构建了人源性抗D二聚体噬菌体抗体,并成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达。     

从人天然抗体库中克隆IgM抗角蛋白抗体

目的：克隆制备人源性抗角蛋白IgM抗体。方法：以人表皮角蛋白为抗原,从人源性天然抗体库中筛选IgM型抗角蛋白人抗体,并用ELISA对所获抗体进行抗原结合活性和特异性等鉴定。结果：通过3轮“亲和吸附－洗脱－扩增”筛选,获得2株IgM型抗角蛋白噬菌体抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因Ⅲ,得到 了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论：从人源性天然抗体库中成功筛选出2株抗角蛋白IgM抗体,为进一步研究抗角蛋白抗体的特性提供了条件。     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用

目的探索大规模制备抗日本血吸虫单克隆抗体的新途径。方法以日本血吸虫感染小鼠的脾细胞为源,构建抗日本血吸虫噬菌体单链抗体库,并对该抗体库进行了富集、筛选和鉴定。同时,用从抗体库制备的可溶性单链抗体对病人血清进行了检测。结果构建的噬菌体抗体库库容为1.07×106cfu。筛选获得2个特异性阳性克隆。这两株克隆表达的单链抗体用于血吸虫病人血清检测的结果为:(1)以其中一株单链抗体检测急性病人的敏感度为60%,检测慢性病人的敏感度为36.7%,特异度为90%。(2)将两株单链抗体混合后检测急性病人的敏感度为75%,检测慢性病人的敏感度为56.7%,特异度为85%。结论首次成功地构建了抗日本血吸虫噬菌体单链抗体库,并从中筛选制备了能有效检测血吸虫病患者血样中的循环抗原的单链抗体。     

特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径     

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。     

抗人IgM抗体对鼻咽癌HNE-1细胞生物学特性的影响

目的 研究抗人免疫球蛋白M(IgM)抗体对鼻咽癌HNE-1细胞增殖、凋亡、细胞周期和成瘤的影响.方法 经抗人IgM抗体处理后,采用细胞增殖抑制实验观察HNE-1细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡及周期,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡;构建裸鼠动物模型,腹腔注射抗人IgM抗体,观察移植瘤的生长,免疫组织化学SP法检测移植瘤中IgM和糖蛋白96(gp96)的蛋白表达.结果 抗人IgM抗体可呈浓度和时间依赖性抑制HNE-1细胞的增殖(P＜0.05);流式细胞术检测表明抗人IgM抗体可促进HNE-1细胞G1期细胞百分比明显降低,S期细胞百分比明显增加,细胞凋亡率明显增高(P＜0.05);TUNEL检测提示抗人IgM抗体可促进HNE-1细胞凋亡(P＜0.01);移植瘤实验显示抗人IgM抗体可明显抑制移植瘤的体积和质量(P＜0.05);移植瘤免疫组织化学显示裸鼠腹腔注射抗人IgM抗体后,移植瘤内IgM和gp96蛋白的表达水平明显低于对照组(P＜0.05).结论 抗人IgM抗体可有效抑制HNE-1细胞的增殖、促进细胞凋亡、阻滞细胞周期,并且能抑制裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与抑制IgM和gp96蛋白表达有关.     

登革2型病毒粘附人血小板的体外研究初探

目的:了解登革2型病毒(DEN-2)是否能在体外粘附人血小板并制备抗人血小板抗体.方法:密度梯度离心法分离血小板,DEN-2与血小板体外共孵育2 h,间接免疫荧光法分析DEN-2粘附人血小板情况.采用TritonX-100裂解法制备血小板蛋白并经皮下注射免疫BALB/C小鼠获取抗血小板血清,经Western blot、...     

全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究

目的 从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法 以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过“吸附-洗脱-扩增”对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集。采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆。阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体。采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性。结果 以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力最高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体。流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11 ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合。结论 通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础。     

抗人FXYD6特异性多肽单克隆功能性抗体制备及生物学作用鉴定

目的 研制抗人转运调节因子(FXYD)6功能区单克隆抗体库,筛选分泌胞内、胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株并对鉴定胞外区单克隆抗体生物学作用.方法 原核表达并纯化去除跨膜区域FXYD6功能区重组蛋白,FXYD6重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,多次筛选及克隆化,建立稳定分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区的单克隆抗体杂交瘤.分别应用间接酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot和免疫组织化学法鉴定抗体特异性及亚型,细胞流式技术筛选可识别天然构象的胞外区单克隆抗体,用腹水诱导法对胞外区单抗进行制备、纯化并检测亲和常数,高表达FXYD6的HepG2细胞系检测胞外区单抗的功能.结果 成功获得分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区单克隆抗体的杂交瘤细胞库,制备出具有功能阻断性的胞外区单抗.结论 制备的抗人FXYD6胞外区单抗可抑制HepG2细胞的增殖.     

Schistosoma japonicum: construction of phage display antibody library and its application in the immunodiagnosis of infection

Background A monoclonal antibody would be an effective tool for the detection of circulating antigens in the serum of patients with schistosomiasis, but the traditional way of producing monoclonal antibodies is not cost-effective. The objective of this study was to find a new method for the large-scale production of monoclonal antibodies against Schistosoma japonicum (Sj).Methods A phage display antibody library for Sj was constructed. To obtain a single-chain variable fragment antibody (scFv) against Sj, the library was screened with metabolic antigens from adult Sj worms (Sj-MAg) using enzyme-linked immunosorbent assay. The soluble scFvs selected were used to detect Sj antigens in the serum of acute and chronic schistosomiasis patients.Results Six positive clones with good reactivity to Sj-MAg were obtained from the phage display antibody library of about 1.07 x 106 individual clones. Only two of these six clones bound specifically to Sj-MAg and were chosen for further analysis. Specific soluble anti-Sj-MAg scFvs were produced by inducing the 2 clones with isopropyI-D-thiogalactopyranoside. The characteristics of the scFvs were then determined. The results of Western blot showed that these scFvs could bind to Sj-MAg specifically and had a molecular weight of about 31 kD. When testing serum from schistosomiasis patients with one of the two specific scFvs, its sensitivity was found to be 60% and 37% in acute and chronic patients, respectively, with a specificity of 90%. When the two specific scFvs were combined,their sensitivity was found to be 75% and 57% in acute and chronic patients, respectively, with a specificity of 85%.Conclusions The results indicate that the scFvs are potentially useful for the diagnosis of schistosomiasis. The library construction also provides a useful tool for the further screening of other antibodies for both diagnostic and immunotherapeutic applications and for epitope analysis and vaccine design.     

胶体金渗滤试验检测乙型肝炎患者血清中IgM抗体的研究

目的建立胶体金免疫渗滤法检测乙型肝炎患者血清中IgM抗体的方法,评价其灵敏度、特异度和重复性。方法以小乙型肝炎表面抗原作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜、抗人IgM抗体作为检测抗体标记胶体金,建立金标免疫渗滤法检测乙型肝炎患者血清中IgM抗体。结果 102份乙型肝炎患者血清,抗HBV IgM阳性标本99份,检出率97%。50份正常血清中,有一份检测结果弱阳性,特异度98%。结论胶体金免疫渗滤法检测乙型肝炎IgM抗体敏感性高、特异性强、重复性好,且方便快捷,不需要仪器设备,在乙型肝炎IgM抗体快速检测上有广阔的应用前景。     

101例红细胞不规则抗体结果分析

目的分析不规则抗体在人群中的分布情况以及不同系统中不规则抗体的分布率,指导临床在输血前进行抗体筛查和疑难配血,以便为待输血者选择相合的血液成分.方法采用室温盐水法和PEG-IAT法,对1998年4月至2002年10月北京市血液中心血型血清研究室7800份样本进行抗体筛查和鉴定,分析抗体的分布情况.结果在被检样本中共发现101例不规则抗体,抗体阳性率为1.3%,其中85%为Rh系统抗体,且以抗-D最多.抗-D抗体中84%以上是在新生儿溶血病样本中发现.配血不合样本中的抗体主要是抗-E及抗-cE.结论患者在输血前或产前应该进行抗体筛查,并对出现的不规则抗体特异性进行鉴定,才能确保输血安全.     

Congenital rubella affecting an infant whose mother had rubella antibodies before conception

A woman who had had high titres of rubella antibodies some months before she became pregnant gave birth to an infant in whom congenital rubella was confirmed at 4 months. Rubella haemagglutination inhibition tests, complement fixation tests, and immunofluorescence tests with anti-human IgG were carried out on sera from the mother. Rubella antibody titres in sera obtained in March 1971, seven and a half months before conception, were equivalent to 400 units, which is usually taken as indicating good immunity. Rubella virus was isolated from the baby's nose and throat in July 1973 but was not isolated from a cervical swab taken from the mother in December 1973; tests of her immunological competence did not show any definite abnormality. The presence of high levels of rubella haemagglutination inhibition antibodies does not invariably confer immunity or exclude the possibility of congenital rubella in a subsequent pregnancy.     

慢性丙型肝炎患者HCV不同基因片段抗体应答与脂代谢关系

目的:探讨慢性丙肝患者HCV感染与脂质代谢的关系及特点。方法:用酶联免疫法检测实验组慢性丙肝患者HCV不同基因片段抗体,并以羊抗人Apo-B血清分离其Apo-B,用PCR法检测Apo-B中HCV-RNA,同时作血脂监测。另设健康人和乙肝病例对照。结果:实验组病例HCV不同基因片段抗体呈现6种分布模式,其血清中均检出HCV-RNA较高载量,相应的Apo-B中(除1例阴性外)均有HCV-RNA表达,血清LDL、Apo-B等水平值显著低于对照组。两对照组血清及Apo-B中无HCV-RNA表达,且不同基因片段抗体阴性。结论:慢性丙肝患者HCV不同基因片段抗体应答与HCV复制密切相关,与Apo-B携带密切相关;其HCV-C和HCV-NS4、HCV-NS5与不同组分载脂蛋白相互作用,可能共同干扰脂质代谢。