幽门螺杆菌中国菌株转位因子IS605的序列分析

目的：研究幽门螺杆菌（Hp）中国菌株转位因子IS605的序列差异。方法：采用PCR扩增、克隆、连接、测序的方法获得不同地区菌株IS605的序列并进行聚类分析比较。结果：中国菌株IS605的核苷酸序列高度保守，不同地区同源性达93%，相同地区同源性达95%，G C含量为35%，与Hp的全基因相似。同源聚类分析表明相同地区IS605的序列相近。结论：IS605是幽门螺杆菌基因组中相当保守的成分，其移位的机制有待于研究。     

幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

浙江地区幽门螺杆菌cagA基因3''区多态性研究

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)的重要毒力基因cagA具有高度保守的5′区和可变的3′区,3′区中重复序列类型和数量的差异造成了cagA基因产物(CagA蛋白)在分子大小上的不同。cagA基因 CagA蛋白的结构差异可能最终影响Hp感染的临床结局。亚洲Hp菌株和非亚洲菌株cagA基因3′区的结构存在明显差异。Yamaoka等研究发现,日本Hp菌株cagA基因3′区可根据重复序列数量和类型的不同分成A、B、C、D 4个亚型,且亚型的差异与Hp感染后不同的临床结局有一定关系。本研究通过聚合酶链反应(PCR)技术对浙江地区Hp临床分离株cagA基因3′区进行多…     

LTB-hpaA融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性鉴定

黏附素 (HpaA)是幽门螺杆菌 (Heli cobacterpylori,Hp)鞭毛鞘膜蛋白 ,几乎存在于所有的Hp菌株表面 ,序列高度保守 ,可作为基因工程疫苗的候选抗原。本文构建了ltB hpaA融合基因原核表达系统pQE32 ltB hpaA E .coliM15 ,并用SDS PAGE、Westernblot和GM1 ELISA分别证实了LTB HpaA重组蛋白 (rLTB hpaA)表达和免疫性。采用常规苯酚 氯仿法分别提取Hp临床菌株Y0 6株和大肠杆菌 4 4 85 1株(中国药品生物制品检定所提供 )DNA。采用PCR扩增hpaA和ltB全基因序列 ,1.5 %溴乙锭预染的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。hpaA和ltB基因…     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列，对比不同毒力弓形虫株（PRU、RH、ME49）中SAG2C基因序列。进行生物信息学分析。方法根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从Prugniaud（PRU）株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因，克隆入pMD19-T载体并进行序列测定。应用DNAMAN软件、NCBI网站（http：／／www。ncbi．nlm．nih.gov／）分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性；利用生物信息学网站ExPASy（http：／／us.expasy．org／）对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列．酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明，获得SAG2C基因序列1225bp，全长cDNA序列1095bp，编码364个氨基酸。同源性分析显示。弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97．14％；Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96．89％；编码氨基酸序列同源性为92％。N端为信号肽，C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白．存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域。结论成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列。序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白。     

幽门螺杆菌omp11基因的克隆及序列分析

目的　对幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)郑州分离株MEL Hp2 7和NCTC116 37株外膜蛋白基因 (omp11)进行克隆和测序 ;确定不同Hp菌株omp11基因序列的变异性 ,并对该基因编码多肽的化学及免疫学特性进行预测 ,为幽门螺杆菌疫苗抗原的筛选提供数据。方法　提取Hp染色体DNA ,用自行设计的PCR引物 ,从染色体DNA上扩增出omp11基因 ,将其克隆到载体pNEB193中 ,用重组质粒转化大肠杆菌 (E .coliJM10 9)。对重组质粒进行酶切鉴定 ,对插入的omp11基因片段进行测序 ,应用生物信息学软件Omiga2 .0、GeneDoc2 .3和GenBank、Swiss port数据库对 4个Hp菌株 (MEL Hp2 7、NCTC116 37、2 6 6 95、J99)的omp11基因序列进行同源性分析 ,并对该基因编码多肽的主要化学特征和抗原结构域进行预测。结果　MEL Hp2 7和NCTC116 37株omp11基因的核苷酸序列长度均为5 6 1bp ,不同菌株间核苷酸序列的同源性为 96 .6 %～ 98.0 % ,与国内的MEL Hp2 7株同源性最高的菌株是NCTC116 37,二者的同源性为 97.9%。 4株Hpomp11基因编码的氨基酸序列长度均为 186aa ,不同菌株间氨基酸序列的同源性为 98.9%～ 10 0 % ,与MEL Hp2 7株同源性最高的菌株是 2 6 6 95 ,二者的同源性为 99.5 %。预测HpMEL Hp2 7omp11基因编码多肽的相对分子质量 (Mr)     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp)热休克蛋白A基因（hsqA)进行核苷酸序列分析。方法 利用PCR技术扩增HspA的DNA,并将其定向插入PinPoint^TMXa-3载体中进行核苷酸序列分析。结果 大气层克隆的HspADNA序列与GeneBank公布的序列有15个碱基存在差异。同源95.8%。结论 所克隆的HspA基因可用于重组表达及相关研究。     

幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达

目的：构建表达幽门螺杆菌（Hp)细胞毒素相关蛋白（CagA)及粘膜免疫佐剂量霍乱毒素B亚单位（CTB）的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法：用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段，从霍乱弧菌扩增CTB基因片段，将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在JM109DE3中表达。结果：重组质粒pEGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符；各表达蛋白经SDS－PAGE分析，相对分子量与文献相符；重组蛋白经Westem blot检测有较强的抗原性。结论：基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备。     

幽门螺杆菌尿毒酶B基因的克隆与高效表达

目的 克隆并表达幽门螺杆菌尿素酶B基因。方法 提取幽门螺杆菌染色体DNA，用PCR方法扩增尿素酶B基因。将其克隆至表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15，IPTG诱导表达。结果 分离得到了1．7kb的 ureB基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达。在37℃诱导表达4h后，表达产物约占细菌总蛋白的34．0％，表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的55．8％。结论 幽门螺杆菌ureB基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

幽门螺杆菌ureB基因的克隆及序列分析

目的 对幽门螺杆菌（Hp)ureB核苷酸序列及推定氨基酸序列进行同源性比较分析,确定Hp菌株的ureB基因差异性,为疫苗的研究和诊断用品的评价提供依据。方法 自选设计引物,PCR扩增来自国内不同病人的4株Hp菌株的ureB基因,与pGEM-T载体克隆连接、测序;进一步同GenBank上发表的其他4株国外Hp菌株ureB的全基因序列进行比较分析。结果 8株Hp菌株的ureB基因序列出现了33种长度,CAPMF3和CPM630分别为1269bp和1680bp,其他为1710bp。6株1710bp的ureB基因序列的分析表明,国外3株Hp的ureB同源性较高,三者氨基酸的同源性达到100％。国内3株Hp的ureB变异较大,推定氨基酸同源性为98．7％－98．9％。结论 UreB作为保护性同时存在免疫保护覆盖率问题,研究疫苗和诊断用品时要注意选择使用在人群中流行占优势的Hp菌株的高度保守的UreB抗原肽,使其具有更高的覆盖率。     

肺炎链球菌青霉素结合蛋白基因pbp2x新的变异与青霉素及头孢噻肟耐药

目的 调查研究肺炎链球菌临床分离株的pbp2x基因和氨基酸序列的变异特点,探讨本地区的肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟的耐药机制.方法 2006年1月-2007年2月收集肺炎链球菌临床分离株34株,进行青霉素及头孢噻肟药敏试验,对青霉素不敏感的肺炎链球菌(PNSP)的青霉素结合蛋白pbp2x基因进行PCR扩增和测序,并进行BLAST分析.结果 有12株PNSP(青霉素及头孢噻肟MIC≥0.5 mg/L)发生了2个重要位点的氨基酸的替换:第一个保守基序STMK内Thr338→Ala及第三个保守基序KSG之前的Leu546→Val氨基酸替换.另外,菌株15发生了第二个保守基序SSN之前的His394→Leu氨基酸替换,而且本研究首次发现了紧邻第一个保守基序STMK后,Met342→Ile位点的氨基酸替换.有17个菌株的pbp2x基因的核苷酸及氨基酸序列出现了新的变异,已向GenBank提交,获得序列号:EU044831、EU089706-EU089709、EU106881-EU106884、EU124672.结论 本地区大多数PNSP的pbp2x核苷酸及氨基酸变异序列高度相似,提示肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟的耐药与pbp2x基因变异相关.     

藏羚羊血红素氧合酶-1基因编码区的克隆及序列分析

目的:克隆藏羚羊血红素氧合酶-1基因编码区,并进行序列分析。方法:从藏羚羊肝组织中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出血红素氧合酶-1(HO-1)基因编码区cDNA片段,与载体连接构建重组质粒,经转化、扩增培养、鉴定后测序,测序结果利用生物信息学的方法进行分析。结果:藏羚羊HO-1基因编码区长度为897,编码298个氨基酸(GenBank登录号为:JQ809687);序列分析表明,藏羚羊HO-1基因的编码区序列与脊椎动物山羊和牛的相似性分别达到98%和96%,氨基酸序列相似性分别达到92%和97%,与其它脊椎动物HO-1基因的核苷酸及氨基酸序列相似性达到86%和87%以上,显示出高度保守性。构建的基于氨基酸序列的分子系统进化树聚类结果表明,藏羚羊与山羊的进化距离最近。结论:本研究成功地克隆出藏羚羊HO-1基因编码区序列,为从低氧细胞保护角度探讨青藏高原土著物种适应高原的分子生物学机制研究提供实验依据。     

人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达

目的 :构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为 180 0 0的外膜蛋白编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法 :用PCR方法从HpDNA染色体中 ,扩增HspA编码基因片段。将目的基因HspA与载体 pET32a( )分别经kpnⅠ和BamHI双酶切后 ,进行连接、测序。同时将重组载体 pET32a( ) /HspA和pET32a( ) /Omp18,分别经HindIII和BamHI双酶切 ,通过凝胶电泳回收pET32a( ) /HspA和Mr180 0 0OMPDNA片段 ,经T4连接酶将HspA和Mr180 0 0OMP编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE30 )中表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,以Westernblot分析其抗原性。结果 :经酶切、测序表明 ,插入的基因片段为HpHspA和Mr 为 180 0 0OMP编码基因 ,由 891个碱基组成 ,与GenBank中登录的序列相比较 ,有 1.15 %的碱基发生变异 ,1.2 6 %的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr 为 5 1× 10 3 ,其中 pET32a( )表达的蛋白Mr 约为 2 0×10 3 ,可溶性表达产物占菌体总蛋白的 18.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。用Westernblot分析显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为 180 0 0OMP单     

幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（heat-labile enterotoxin Bsubunit，LTB）的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗，并通过13服免疫小鼠研究其抗原性，为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA．ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL，转化E．coliB121（DE3），进行原核表达，重组表达蛋白采用HK26／60Superdex-75分子筛和亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化，Tris-Tricine电泳和Westemblot鉴定，GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合。口服免疫Balb／c小鼠，检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约1590bp的NHUL融合基因；其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达，表达量约占细菌总蛋白的25％，Tris-Tficine初步测定目的蛋白的肘，约59000，纯化后纯度大于90％。Westemblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性。动物实验表明，多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IsA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sigA抗体显著高于单一亚单位疫苗。结论所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性，为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

表达幽门螺杆菌NAP基因的减毒沙门菌疫苗株的建立

目的：建立表达幽门螺杆菌(H．pylori)中性粒细胞活化蛋白(Hp—NAP)的减毒沙门菌疫苗株。方法：用PCR扩增Hp—NAP基因，并克隆至原核表达质粒pTrc99A中，经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列，并与GenBank中相关序列的同源性进行比较。以重组质粒pTrc99A—NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261，培养后筛选阳性菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp—NAP蛋白用SDS—PAGE进行鉴定，用薄层扫描分析蛋白含量。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实，克隆的Hp—NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98％(397／402)，氨基酸序列的同源性为98％(131／133)。以重组质粒pTrc99A—NAP转化的减毒沙门菌，可表达Mr约15000的Hp—NAP蛋白，表达量约占菌体蛋白量的37．5％。结论：建立了可表达Hp—NAP基因的减毒鼠伤寒沙门疫苗株，为进一步研制Hp口眼疫苗奠定了基础。     

一例ABO血型重组等位基因的分子特性

目的分析一例ABO血型重组等位基因的分子特性。方法ABO表型鉴定采用试管法。ABO基因和FUT1基因编码区序列检测采用PCR测序法。利用等位基因特异性引物扩增测序技术鉴别先证者ABO等位基因。先证者及其母亲ABO基因全长序列测定采用二代测序方法。结果先证者红细胞与抗H不凝集,FUT1基因为c.551_552del AG纯合,判定先证者为类孟买型。先证者ABO基因双链测序结果为c.261G/del、467C>T、c.526C>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A杂合。单链测序结果显示先证者有一个ABO*A1.02等位基因,另一个为ABO*O.01.01和ABO*B.01重组形成的等位基因。二代测序数据显示可能重组的位置在核苷酸c.375-269到c.526之间,家系分析显示先证者重组等位基因遗传自母亲。结论ABO血型等位基因存在重组现象。发现了1例ABO*O.01.01和ABO*B.01重组形成的新等位基因。     

Molecular Cloning and Phylogenetic Analysis of ORF7 Region of Chinese Isolate TH-98 from Transmissible Gastroenteritis Virus

Genomic RNA was extracted from a Chinese isolate of porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) designated TH-98. Employing RT-PCR technique to amplify ORF7 sequence of TGEV, which located at the 3 end of TGEV genome and is poorly understood functionally so far. A recombinant named pPROEX HTc-hp was constructed via inserting ORF7 gene into prokaryotic expression vector pPROEX HTc. The recombinant was sequenced and compared the DNA and its deduced amino acid (aa) sequences with that of some reference strains after restriction endonuclease and PCR analysis. The ORF7 gene named hp gene (Genbank accession number: AY337931) consists of 237 bp in length encoding a hydrophobic protein (HP) of 78 aa with a molecular weight of 9.1 kDa. The sequences of hp gene and Hp protein share 89%–97% and 87%–96% homologous identities compared with 11 TGEV reference strains derived from other regions or countries respectively, which revealed that there are significant variation within-strains, even though the ORF7 region is relatively conservative. In addition, a phylogenetic tree based on these ORF7 DNA sequences was generated, and the tree topology suggests that possible recombination events happened in the evolutionary history of TGEV.Jie-Chao Yin,Xiao-Feng Ren contributed equally to this work.     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

广州地区人巨细胞病毒临床低传代株UL136基因的序列特征及多态性

目的 研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代株UL136基因的序列特征与基因多态性.方法 从10例广州感染新生儿体内分离获得2株(D2、D3)临床HCMV分离株,经多重PCR鉴定后进行UL136基因全序列扩增.PCR产物纯化后进行基因克隆,构建HCMV UL136-pMD18-T重组质粒.经基因测序及应用生物信息学分析方法 ,分析其核酸序列稳定性、编码蛋白质的二级结构与特征.结果 成功分离2株HCMV临床分离株,测序结果 显示,D2、D3及与GenBank中公布的11株临床分离株(4J、51C、39J、33J、63J、22M、10J、32C、29C、27C、Toledo)中,UL136序列高度保守.同源性分析显示在UL136全基因序列1019个核苷酸中,存在30个位点变异,所有的变异均为碱基替换,无插入及缺失突变.编码蛋白的氨基酸序列也高度保守,240个氨基酸残基中,不同临床分离株氨基酸变异率为1.6%～3.7%.不同分离株的UL136蛋白中参与形成二级结构的氨基酸数目及等电点不同.进化树分析结果 显示D2和D3均属于1a群.结论 广州地区临床低传代分离株HCMV UL136基因核苷酸序列及其氨基酸序列极为保守,但仍存在一定多态性.其基因的稳定性提示HCMV UL136开放阅读框(ORF)可能是一个具有重要功能的基因.其编码后修饰位点提示UL136可能与膜受体介导的细胞信号转导通路有关.     

cDNA encoding an immunogenic region of a 22 kilodalton surface protein of Eimeria acervulina sporozoites

cDNA encoding an immunogenic region of a 22 kDa surface protein of Eimeria acervulina sporozoites was cloned and expressed in the bacteriophage lambda gt11 vector. The recombinant beta-galactosidase fusion protein, designated MA1, has an apparent molecular size of 125 kDa. Immunofluorescence staining of intact E. acervulina sporozoites and merozoites and immunoblotting of 125I-surface labeled protein from both stages revealed exclusive expression of the cloned cDNA in the sporozoite stage. The gene encoding the 22 kDa surface protein appears to exist as a single copy sequence as revealed by Southern blot hybridization utilizing the cDNA insert as a probe. Although not recognized by immune serum, purified recombinant MA1 antigen induced significant in vitro activation of T lymphocytes obtained from chickens immune to E. acervulina. DNA sequencing and hydropathic analysis of the predicted amino acid sequence revealed a central hydrophilic region surrounded by two hydrophobic areas which may represent exposed and transmembrane regions of the protein.