海外文摘

日本酿造用代表性曲菌的遗传基因排列顺序(EST)的破译工程是产工学一体的联合团队与德国产品评定技术基础机构(NITE)合作共同完成的。其中包括对曲霉菌(Aapergrillusoryzae)酶遗传基因碱基对整体和局部排列进行的破译,搞清了影响酶特性的关键性控制基因,通过转基因工程提高特定酶的产量,培育产酶高的曲菌。     

酱油微生物遗传特性的研究进展

从酱油酿造用曲菌及酵母遗传基因上的特性,来重新认识传统的发酵菌类,完全突破了传统的微生物鉴别法.以基因片等手段快速准确地鉴定菌种,极大地提高和改善了酿造微生物的产酶和发酵性.本文从曲菌的繁殖、酶生成、耐盐性、曲菌蛋白酶产生的多样性、固态及液态培养等方面阐述了酿造微生物的遗传特性.     

2005年酒类研究业绩

奥田等对15℃长期储藏的清酒进行调查后发现，在斩米时该大米的碎米率和无效处理率都比较高。而米的消化率、Brix、甲醛氮值却与对照相同。加藤等对附着于黄曲菌Aspergillrs oryzae和白曲菌Aspergillus kawachii细胞壁上和游离于培养液中的酶分别进行了定量，发现固体培养时附着在细胞壁上的酶要比液体培养时少得多。且液体培养以甘油和葡萄糖为碳源时，白曲菌产生的AU-amylase（α-淀粉酶遗传基因）与麦芽糖为碳源时没有差别，但黄曲菌以麦芽糖为碳源产生的TAKA-amylase相比则少。     

紫苏叶对红曲菌产色素和莫纳可林K及抗氧化物的影响

以高产莫纳可林K（MK）及红曲色素（MPs）、不产桔霉素的丛毛红曲菌（Monascus pilosus）MS-1为实验菌株,优化已有的固态发酵工艺,考察添加紫苏叶对红曲菌产MPs、MK及抗氧化物的影响。结果表明,添加10%紫苏叶时MPs和MK的产量最高（P＜0.05）。添加紫苏叶及紫苏叶提取液均可显著促进菌株MS-1产MPs和MK（P＜0.05）,但两种添加方式对菌株MS-1产MPs及MK的影响无显著差异（P＞0.05）。添加紫苏叶后色价和MK产量可分别达211.73 U/g和8.15 mg/g,分别为对照的1.35和1.36倍。紫苏红曲粗提物的DPPH清除率显著高于对照（P＜0.05）,可达48.71%。然而,紫苏红曲中迷迭香酸含量仅为0.032 mg/g,而紫苏叶中迷迭香酸含量高达14.71 mg/g。添加紫苏叶不仅可促使红曲菌产MPs及MK,还可能促使红曲菌产抗氧化物质,从而提高其发酵产物的抗氧化能力。     

红色红曲菌液态发酵产胞外淀粉酶的研究

通过对红曲菌胞外淀粉酶活力的检测初步研究了红色红曲菌液态发酵产淀粉酶的特性。研究表明,红色红曲菌在液态发酵培养过程中分泌的胞外淀粉酶主要为葡萄糖淀粉酶,产酶时间略提前于红曲菌菌丝体生长高峰期,在培养第2天达到最高值。葡萄糖淀粉酶分泌的最适碳源为6%淀粉,最适氮源为2%蛋白胨,发酵最适条件为32℃,初始pH6,接种量5%。红曲菌产葡萄糖淀粉酶的较佳培养条件与红曲菌较适生长条件基本相符。红曲菌在液态发酵过程中几乎不产胞外α-淀粉酶。无论是固态培养还是液态发酵,红色红曲菌的产淀粉酶能力均低于紫色红曲菌。     

不产桔霉素高产红曲色素的基因工程红曲菌株构建

以一株高产红曲色素的紫色红曲菌（Monascus purpureus）J01为研究对象,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导 的T-DNA转化技术,敲除紫色红曲菌株J01基因组中的桔霉素合成关键基因pksCT,构建一株不产桔霉素高产红曲色素的红曲菌株。 结果表明,通过菌落形态观察和生物量测定得出,菌株J42与菌株J01的菌落形态及生物量无显著性差异（P＞0.05）;经高效液相色谱（HPLC）与液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析得出,菌株J01的桔霉素含量为5.1mg/kg,pksCT基因敲除菌株J42菌丝体中未检测到 桔霉素;菌株J42的黄色素,橙色素和红色素色价分别为1 877 U/g、773 U/g、1 068 U/g,显著高于菌株J01（P＜0.01）,并且菌株J42的红 曲色素总色价为415 U/mL,是原始菌株的1.56倍,成功构建了一株不产桔霉素高产红曲色素的生产菌株J42。     

手性农药在红曲菌发酵过程中的立体选择性行为研究

采用高效液相色谱-串联质谱联用技术,研究了手性农药腈菌唑、己唑醇在红曲菌液态发酵和红曲酒酿造过程中的立体选择性降解情况,以及对红曲菌产酶(糖化酶、纤维素酶)和典型代谢产物(红曲色素、桔霉素)的影响.结果表明,腈菌唑、己唑醇的对映异构体的降解速率基本一致,无选择性降解现象发生.腈菌唑、己唑醇的外消旋体及对映异构体对红曲菌产酶和代谢物呈现一定的差异性,其中,在5,0.5 mg/L己唑醇条件下,红曲菌产酶及代谢物表现出显著性变化,且(+)-己唑醇显著性大于(-)-己唑醇,5 mg/L质量浓度下显著性大于0.5 mg/L;在0.05 mg/L己唑醇条件下,红曲菌产酶及次级代谢均不存在显著性差异.此外,不同质量浓度的腈菌唑外消旋体及对映异构体对红曲菌产酶及次级代谢也不存在显著性影响.     

福建红曲中红曲菌的分离鉴定及菌株特性研究

采用选择性培养基分离纯化福建各地区红曲样品中的红曲菌,得到17株红曲菌纯菌株。经菌落形态特征观察,生理生化试验以及分子生物学鉴定手段,17株红曲菌被鉴定为变红红曲菌(M.serorubescens Sato)、橙色红曲菌(M.aurantiacus)、新月红曲菌(M.lunisporas)、血红色红曲菌(M.sanguineus)和高粱红曲菌(M.kao-liang)五大类。通过液态发酵法研究红曲菌产糖化酶,产色素以及产生理活性物质莫纳可林(Monacolin K)能力,结果表明不同红曲菌菌株特性存在显著性差异,其中被鉴定为高粱红曲菌的B6菌株具有最高的产色素能力和产莫那可林K(Monacolin K)能力,其醇溶性总色价为3373.12U/g,酸式和内酯式莫那可林K产量分别为25.928mg/L和12.114mg/L,产淀粉酶酶活力为543.21U/g。B6菌株是可用于红曲黄酒酿造的优良红曲菌菌株。     

茅台酒曲中分离红曲霉酶系及发酵性能研究

从茅台酒曲中分离到一株红曲霉M1，经鉴定属于子囊菌纲（Ascomgcetes）、不整子囊菌目（Plectascal）、曲菌科（Eurotiaceae）、红曲菌属（Monascus Van Tieghem）、红色红曲霉（Monascus rubervam tieghem）。M1菌株的酶学性质厦发酵性能初步研究表明，红曲霉菌株M1可以产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶和酯酶；具有生产红曲色素、Lovastatin、麦角固醇和乙醇的能力。     

用曲菌量产酶

曲菌的产酶能力,一般认为固体培养要高于液体培养。为此试图在液体培养下提高产酶的可能性,但在实际生产中难以实现。     

用大豆原料进行发酵的高附加值化

大豆发酵制品具有很强的抑制脂肪氧化的作用。将发酵大豆制成的酱、纳豆、甜片（印尼）进行比较，抗氧化强弱的顺序是大酱〉甜片〉纳豆，它们之间抗氧化力的差异与配基型异黄酮有关。异黄酮变成配基型是由β-糖苷酶完成的，制酱用的曲菌是米曲霉属，制甜片的曲菌是根霉属，根霉菌产β-糖苷酶比曲霉菌低，而纳豆菌基本上不产生这种酶，由曲菌等微生物发酵而成的酱油，在压榨之后其酱油渣中含有配基型异黄酮，这种物质有缓和妇女更年期不适的作用。也就是说，现在未被利用的酱油渣资源可能是附加值很高的功能性原料。     

不同红曲菌中红曲色素与橘霉素的比较分析

红曲菌可产生红曲色素（Monascus pigments,Mps）等多种有益的次级代谢产物,但部分红曲菌产生的橘霉素（citrinin,CIT）引起了人们对红曲产品安全性的关注。本研究以22?株红曲菌（含14?株模式菌株）为研究材料,通过复合萃取剂前处理方法和超高效液相色谱法分析其发酵红曲米中Mps和CIT含量,结果表明13?株菌可同时产生Mps和CIT,4?株菌只产生CIT不产生Mps,5?株菌既不产Mps也不产CIT,Mps产量最高的菌株是紫色红曲菌3.4443,CIT产量最高的菌株是橙色红曲菌3.4384。利用主成分分析发现在产Mps和CIT的红曲菌株中,黄、橙色素与橘霉素呈正相关,而红色素与橘霉素呈负相关。该结果可为系统分析红曲菌株代谢产物差异,高产Mps产品开发提供参考。     

应用抑制性消减杂交法筛选与红曲菌产桔霉素相关的基因

为了筛选与红曲菌产桔霉素相关的基因，应用抑制性消减杂交(SSH)构建了两个红曲菌的cDNA消减文库。利用分子生物学软件从这两个文库中找出八条同源序列，通过Blast软件对这八条序列进行分析，结果显示，它们可能是新的基因片段，递交后被Genbank接收。     

DNA条形码基因ITS和LSU在红曲菌分类鉴定中的比较分析

为评估DNA条形码基因核糖体内转录间隔区（ITS）和核糖体大亚基（LSU）在红曲菌分类鉴定中的有效性,从NCBI的GenBank数据库中下载现阶段红曲菌属所有物种的ITS和LSU基因序列,采用系统发育和遗传距离的方法对其进行分析,并用该研究所保存的部分红曲菌株的DNA序列进行验证。结果表明,同种红曲菌的不同菌株在基于ITS序列的邻接树中分别聚为单系;紫色红曲菌（Monascus purpureus）、佛罗里达红曲菌（Monascus floridanus）和蜂蜜红曲菌（Monascus mellicola）的同种不同菌株在基于LSU序列的邻接树中分别聚为单系。新月红曲菌（Monascus lunisporas）的ITS和LSU序列以及红色红曲菌（Monascus ruber）和累西腓红曲菌（Monascus recifensis）的LSU序列的条形码间隙不明显,其他红曲菌的ITS和LSU序列条形码间隙明显。同种红曲菌ITS序列的最小及最大种间遗传距离均高于LSU序列。研究表明ITS基因在红曲菌的分类鉴定中具有高效性,LSU基因在红曲菌分类鉴定中的分辨力有限。     

红曲霉菌株固态发酵特性的比较研究

以籼米为固态培养基分别对8株红曲菌的发酵特性进行研究,比较其产糖化酶、产色素以及产桔霉素的能力,筛选出可应用于红曲黄酒酿造的优良红曲霉菌株。结果表明不同红曲菌的菌株特性存在显著性差异,成曲中橙色红曲菌(M.aurantiacus)B5菌株具有最低的产桔霉素能力,较高的产色素和产糖化酶能力,其桔霉素产量9.06μg/g,醇溶性总色价420.82 U/g,水溶性总色价117.6 U/g,产糖化酶酶活力410.7 U/g。B5菌株是可应用于红曲黄酒酿造的优良红曲菌。跟踪菌株B5在制曲过程中代谢产糖化酶、色素及桔霉素能力的变化情况,综合各个指标的变化趋势得出制曲最佳时间为9 d。     

根瘤农杆菌介导的紫色红曲菌遗传转化体系的研究

通过构建根瘤农杆菌介导的红曲菌遗传转化体系,将含有桔霉素生物合成基因同源片段的T-DNA导入紫色红曲菌Monascus purpureus SM005的子囊孢子中,以期对产桔霉素的关键酶基因pksCT进行定向敲除.优化得到的遗传转化系统为进一步对红曲菌进行分子生物学操作提供了一条高效可行的途径.     

紫外-化学诱变筛选高产莫纳可林K或色素的红曲菌株

为获取能稳定高产莫纳可林K（MK）或红曲色素（MPs）的红曲菌株,以不产桔霉素的丛毛红曲菌（Monascus pilosus）MS-1为 出发菌株,经紫外诱变、氯化锂化学诱变及紫外-氯化锂复合诱变分别得到红曲菌11株、2株和3株,对16株诱变菌进行复筛和遗传稳 定性试验研究,得到4株产MPs或MK能力提高且遗传稳定性较好的诱变菌株。 其中诱变菌株ZWS5产MPs总色价为1 476.25 U/g,与出 发菌株MS-1相比产MPs能力提高了23.36%;诱变菌株ZWN2、LHL1和FH2的MK产量分别为7.34 mg/g、7.03 mg/g、和7.16 mg/g,比出发 菌株MS-1产MK能力分别提高了27.65%、22.26%和24.52%。     

酯化型红曲菌复合诱变选育及其固态发酵条件优化

为了获得高酯化力红曲菌,采用紫外线结合常压室温等离子体复合诱变对实验室保藏的红曲菌进行诱变育种,并通过单因素实验及响应面分析法优化其固态发酵条件,提高菌株产酯化酶能力。出发菌株N3经过复合诱变,采用透明圈法初筛及酯化酶活力测定法复筛,得到1株产酯化酶活力高且遗传稳定性较好的诱变菌株Z14,其酶活稳定至34.44 U/g,较出发菌株提高了74%。通过响应面分析法得到优化的固态发酵条件为:接种量为5%、含水量为70%、培养时间为7 d。在该条件下Z14产酯化酶活力达到38.53 U/g,较出发菌株提高了95%。     

烧酒白曲菌非耐酸性α-淀粉酶的特异性

烧酒的原料有大米、大麦和白薯等，其主要成分是淀粉质，在酵母进行酒精发酵之前，必须用淀粉酶对淀粉进行糖化。酿造清酒是用黄曲菌（Aspergillus oryzae），酿造烧酒是用白曲菌（A．kawachii）     

枯草芽孢杆菌产纤溶酶发酵条件的研究

在实验室筛选到一株产纤溶酶较强的枯草芽孢杆菌，通过研究发现其最适产酶的发酵条件为：ρ（葡萄糖）＝20g/L、ρ(豆渣）＝60g/L、ph7.0、温度37℃、种龄24h、接种量10％。发酵第四天产酶最高，最大产酶量可达713.11IU/mL。