用间接ELISA检测抗H9亚型AIV独特型单克隆抗体的研究

目的为制备抗H9亚型A型流感病毒(AIV)独特型杂交瘤细胞系,运用异种动物间共有独特型理论建立的间接ELISA进行检测.方法本试验采用兔抗H9亚型低致病力AIV IgG作为检测抗原,通过预试验确定了包被抗原的工作浓度为800μg/mL,以间接ELISA方法检测融合细胞培养上清液,筛选到产生抗AIV鸡和兔种间共有独特型抗体的杂交瘤细胞.结果间接ELISA试验中P/N值达12,效价达到2-4,证明杂交瘤细胞株分泌目的单克隆抗体的能力强.结论该检测方法排除了分泌抗鸡同种型表位以及超变区其他表位抗体的杂交瘤细胞,从而成为筛选分泌抗H9亚型AIV独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株的可靠方法.     

用间接ELISA检测抗H9亚型AIV独特型单克隆抗体的研究

目的为制备抗H9亚型A型流感病毒(AIV)独特型杂交瘤细胞系，运用异种动物间共有独特型理论建立的间接ELISA进行检测。方法本试验采用兔抗H9亚型低致病力AIV IgG作为检测抗原，通过预试验确定了包被抗原的工作浓度为800μg/mL，以间接ELISA方法检测融合细胞培养上清液，筛选到产生抗AIV鸡和兔种间共有独特型抗体的杂交瘤细胞。结果间接ELISA试验中P／N值达12，效价达到2^-4，证明杂交瘤细胞株分泌目的单克隆抗体的能力强。结论该检测方法排除了分泌抗鸡同种型表位以及超变区其他表位抗体的杂交瘤细胞，从而成为筛选分泌抗H9亚型AIV独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株的可靠方法。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的 :制备抗禽流感病毒 (AIV)H9亚型血凝素蛋白的单克隆抗体 (mAb)。方法 :以AIVH9亚型油乳剂灭活疫苗作为免疫原 ,免疫 8wk龄BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb ;采用ELISA和血凝抑制试验(HI)检测腹水mAb的效价 ;采用ELISA、HI、免疫荧光染色 (IF)及Westernblot鉴定mAb的特异性。结果 :获得 3株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株 2A3、2H1和 1C8,其腹水mAb的ELISA效价依次为 1× 10 7、1× 10 5和 5× 10 6,血凝抑制效价为 1× 2 8～ 1× 2 13 ;3株mAb的Ig亚类均为IgG1。以mAb 2H1进行Westernblot的结果显示 ,该mAb能与AIV的Mr 为 75 0 0 0的蛋白条带起反应 ,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb。与 32株AIVH9亚型国内分离株进行血凝抑制试验表明 ,mAb 2H1具有良好的广谱性。结论 :成功地制备了抗AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb ,为AIV的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量的监测及流行病学调查等奠定了基础     

C-myc单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备与鉴定鼠抗C-myc蛋白单克隆抗体。方法利用C-myc蛋白做免疫原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆、单克隆抗体Ig亚型鉴定,获得2株能够稳定分泌抗C-myc特异性抗体的杂交瘤细胞株,再将杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔诱使小鼠产生腹水。结果获得2株可稳定分泌抗C-myc抗体的杂交瘤细胞株,命名为SHH-1H11,SHH-2A9,Ig亚型分别为IgG1亚类和IgM。细胞培养上清效价分别为1:10240、1:5 120;小鼠腹水效价分别为1:64 000、1:32 000。结论制备的C-myc单克隆抗体仅与C-myc蛋白反应,与其他蛋白没有交叉反应,表明获得的单克隆抗体的特异性很高。     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)单克隆抗体,为rLZ-8的药效学及药代动力学研究奠定基础.方法:以纯度99%的rLZ-8免疫BALB/c小鼠;应用常规的细胞融合技术建立一种能够稳定分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔接种法制备腹水;Protein A Sepharose 亲和层析柱在AKTA纯化仪上对抗体进行纯化;间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价;Western blot胶片曝光方法对rLZ-8单克隆抗体特异性进行分析.结果:筛选出2株可特异性分泌抗rLZ-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株.分别命名为clone13-2-3和clone11-4-4.其抗体亚型分别为IgG1亚型和IgG2a亚型.腹水抗体效价分别为1:12 000和1:7 500,细胞培养上清效价分别为1:3 000和1:2 800.Western blot检测证明这两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均具有良好的特异性.结论:成功制备出较高效价和较高特异性的鼠抗rLZ-8的单克隆抗体.     

嗜水气单胞菌抗独特型单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备嗜水气单胞菌(Aeromonas hydophila)抗独特型单克隆抗体(AId mAb)并进行鉴定.方法:以具有中和作用的抗嗜水气单胞菌 mAb 1G10免疫 BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备嗜水气单胞菌 AId mAb.用 ELISA法对 mAb的效价及其模拟嗜水气单胞菌的特性进行鉴定.结果:获得4株能稳定分泌嗜水气单胞菌 AId mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1F9、 1H10、 3F5、 4G3.经测定杂交瘤细胞腹水 mAb效价为10 -4～10 -5.竞争抑制实验结果表明 4株 AId mAb均能不同程度地抑制嗜水气单胞菌与兔抗嗜水气单胞菌多克隆抗体结合,其中两株 1F9、 1H10具有较强的抑制作用.用作制备抗独特性抗体腹水的小鼠,其血清均能检测与嗜水气单胞菌进行免疫结合的抗体,经 ELISA检测,其效价为 1: 100 ～1: 1 000.结论:成功地制备了产生嗜水气单胞菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株,为制备该菌的抗独特性抗体疫苗奠定了基础.     

眼镜王蛇毒单克隆抗体的制备

目的:应用眼镜王蛇毒基因疫苗,免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体(mAb).方法:应用眼镜王蛇Oh-3基因真核表达质粒pIRES-Oh3,佐以脂质体制成基因疫苗,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与同源Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,制备mAb.结果:获得了2株分泌抗眼镜王蛇毒mAb的杂交瘤细胞株(F5、 F11),细胞培养上清液的抗体效价分别为3.2×10-1、 6.4×10-1,腹水抗体效价分别为1.28×10-4、 2.56×10-4.结论:成功地制备了2株眼镜王蛇毒mAb.     

H4亚型禽流感血凝素单克隆抗体的研制及夹心ELISA的建立

目的制备H4亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体(mAb),基于mAb建立H4亚型AIV夹心ELISA检测方法。方法用灭活H4亚型AIV免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、血凝抑制(HI)试验筛选和亚克隆,得到了一株抗H4亚型AIV mAb(6G4)。免疫荧光细胞化学染色和Western blot法验证6G4与H4亚型AIV的反应性, HI试验鉴定6G4特异性、广谱性和稳定性,试剂盒鉴定6G4亚类。以鸡抗H4亚型AIV多克隆抗体作为包被抗体, 6G4作为捕获抗体, HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为酶标抗体,通过条件优化和一系列验证,建立H4亚型AIV夹心ELISA检测方法。结果 6G4亚类为IgG1,轻链为κ链,能稳定分泌抗体,具有良好的反应性、特异性、广谱性和稳定性;基于6G4建立的ELISA特异性强、敏感性高、重复性好,适合大批量检测。结论成功制备了抗H4亚型AIV的mAb,建立了检测H4亚型AIV的夹心ELISA。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

Preparation of anti-idiotypic antibody against avian influenza virus subtype H9

To generate monoclonal anti-idiotypic antibodies(mAb2)against avian influenza virus subtype H9(H9 AⅣ),BALB/c mice were immunized with purified chicken anti-H9-AⅣ IgG and the splenocytes of immunized mice werefused with myeloma cells NS-1.Hybridoma cells were screened by indirect enzyme-linked immunosorbent assayswith both chicken and rabbit anti-H9-AⅣ IgG as coating antigens.One hybridoma cell clone secreting monoclonalantibody against idiotypes shared by both chicken and rabbit anti-H9-AⅣ IgG was established.Experimentsdemonstrated the mAb2 was able to inhibit the binding of hemagglutinin to anti-H9-AⅣ IgG and to inducechickens to generate hemagglutination inhibition antibodies,indicating this anti-species-sharing-idiotypic antibodybore the internal image of hemagglutinin on avian influenza virus.Cellular & Molecular Immunology.2005;2(2):155-157.     

登革病毒非结构蛋白NS1群特异性单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1～4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础。方法应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结果从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母（Pichia Pastoris-NS1）中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,最终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8000～1∶16000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1～4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结论成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。初步建立了可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法。     

基于基因免疫制备抗人绒毛膜促性腺激素β亚基单克隆抗体及其特性研究

用真核表达人绒毛膜促性腺激素β亚基((human chorionic gonadotrophinβ,hCGβ)的重组质TR421-hCGβ免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,ELISA法筛选阳性细胞株,经过多次的克隆化培养,最终获得10株持续、稳定分泌抗hCGβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。随机抽取6H1杂交瘤细胞进行抗体的制备、纯化及免疫学特性的分析。间接ELISA法证明6H1单抗属于IgG2a亚类。Western blot证明6H1单克隆抗体可以特异性结合hCGβ,间接免疫荧光和流式细胞仪等结果表明,6H1单克隆抗体能够不同程度的结合不同来源的肿瘤细胞膜上表达的hCGβ分子,为进一步研究其生物学功能奠定了物质基础。     

一种狂犬病实验室诊断用单克隆抗体制备新路线的探索

目的 探索采用合成肽作为免疫原制备狂犬病实验室诊断用单克隆抗体的可行性.方法 以狂犬病病毒CVS-11核蛋白355-369位B细胞线性抗原表位合成肽与钥孔戚血蓝蛋白（Keyhole Limpe hemocyanin,KLH）大分子耦联后免疫BALB/c小鼠,利用经典杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体.采用间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和间接荧光试验（indirect fluorescent assay,IFA）筛选和鉴定杂交瘤细胞株.结果 经过对杂交瘤细胞株上清的间接ELISA和IFA筛选获得阳性杂交瘤细胞株2B1D11,该杂交瘤细胞株产生的抗体经纯化后在IFA中可以有效检出感染犬脑组织和BHK-21细胞的狂犬病病毒.结论 采用合成肽作为免疫原制备狂犬病实验室诊断用抗体在技术上是可行的.     

抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B(GPA/GPB)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用人“O”型血红细胞作为免疫源,免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,用谱红细胞筛选阳性克隆;采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价。分别用快速定性试纸和酶处理红细胞检测mAb的Ig亚类及抗原表位。用Western blot鉴定抗GPA/GPB mAb的特异性。结果:获得4株分泌抗M、1株抗N及3株抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞培养上清mAb的效价介于1×2-4~1×2-8之间,腹水mAb的效价在1×2-7~1×2-12之间。除1株mAb 1C1C9C4为IgM外,其他7株mAb均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAb抗原表位的检测,确定4株和1株mAb可分别特异性结合于GPA的M、N抗原表位;另3株mAb 6D7C9、7C9H4和7C9G11与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,均可结合GPA、GPB蛋白。结论:成功地建立了4株分泌抗M、1株分泌抗N及3株分泌抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株,可用于MNSs血型系统的研究及鉴定,并为制备双功能抗体用于病毒、肿瘤疾病的诊断和治疗打下了坚实的基础。     

抗O139群霍乱弧菌单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备抗O139群霍乱弧菌(vibriocholeraeO139)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性,为进一步研制检测O139群霍乱弧菌的胶体金免疫试纸条创造条件。方法以灭活的O139群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗O139群霍乱弧菌的mAb。采用间接ELISA方法和Westernblot对mAb的特异性进行鉴定。采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、检测其腹水效价及相对亲和力,并进行表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(O4D7和O4D10),其Ig亚类分别为IgG2b和IgG3;腹水mAb的效价均为1∶107;mAbO4D7的相对亲和力在1×105以上,O4D10在1×104以上。ELISA相加实验的结果显示,2株mAb可识别不同的抗原表位。结论成功地制备抗O139群霍乱弧菌的两株mAb,为建立快速特异检测O139群霍乱弧菌感染的试验方法提供了有力的工具。