抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法 通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK?MEL?1、Hs?695T、MDA?MB?435s、WM35）及色素痣细胞中的表达,实时荧光定量PCR检测2014 年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）?Flag?Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3 质粒（转染组）至恶性黑素瘤 A375 细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证 DKK3 的过表达,及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达,在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2?ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150） × 10?3、（0. 142 ± 0.210） × 10?3、（0. 634 ± 0.120） × 10?3,差异有统计学意义（F = 46.57,P < 0.05）,转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣 （LSD?t分别为2.48、3.12,均P < 0.05）。A375 细胞转染DKK3后,细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t = 2.36,P < 0.001）;迁移及侵袭实验中,转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）,差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35,均P < 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后,上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调,DKK3过表达后A375 细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。     

抑癌基因DKK3对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及其对黑素瘤细胞A375增殖与凋亡的影响。方法 通过反转录（RT）？PCR及实时定量PCR分析DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK？MEL？1、Hs？695T和MDA？MB？435s及38例原发性黑素瘤、4例转移性黑素瘤和20例色素痣组织中的相对表达。分别转染恶性黑素瘤A375细胞pcDNA3.1（＋）？Flag？DKK3 质粒（实验组）和pcDNA3.1（＋）？Flag？Vector 质粒（对照组），RT？PCR 验证 DKK3 的过表达；通过CCK8法和平板克隆实验分析 DKK3 对A375细胞增殖的影响，流式细胞仪分析 DKK3对A375细胞凋亡的影响，Western印迹检测A375细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。结果 DKK3 mRNA 在WM35细胞系表达下调，HM、A375、WM451、SK？MEL？1和Hs？695T细胞系表达缺失，MDA？MB？435s细胞高表达。与色素痣相比，DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤组织表达降低（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比 （100%），实验组A375细胞克隆形成效率明显受到抑制（23.22% ± 3.55%）；同时转染后24、48、72 h细胞活性受到明显抑制（均P 〈 0.05）。流式细胞仪检测发现，与对照组A375细胞（G1期，25.38% ± 2.92%）相比，实验组A375细胞明显阻滞于G1期（48.68% ± 3.92%，P 〈 0.001），细胞凋亡率明显升高（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比，实验组周期凋亡相关蛋白p21、Bax、活化的parp和 活化的Caspase？3表达升高，细胞周期蛋白D1和Bcl2表达降低（均P 〈 0.001）。结论 DKK3在人皮肤恶性黑素瘤组织中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤的进展。     

泛素连接酶Cbl-b在黑素瘤组织和细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义

目的：探讨泛素连接酶Cbl?b在皮肤黑素瘤组织及黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法收集69份黑素瘤、30份色素痣组织,采用免疫组化法检测Cbl?b蛋白表达水平。实时荧光定量PCR、免疫印迹法分别检测黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中Cbl?b mRNA及蛋白表达水平。结果69份皮肤黑素瘤标本中,52份（75.36%）表达Cbl?b;30份色素痣标本中,4份（13.33%）表达Cbl?b,两组Cbl?b蛋白表达水平差异有统计学意义（χ2=32.745,P<0.01）。黑素瘤组织中Cbl?b表达水平与肿瘤进展程度、Clark分级和Breslow厚度均呈正相关（rs分别为0.569、0.654、0.727,均P<0.01）。实时荧光定量PCR显示,A375、M14、MV3细胞Cbl?b mRNA表达差异有统计学意义（F=176.537,P<0.01）。免疫印迹法显示,A375细胞Cbl?b蛋白表达水平最高,黑素细胞最低。结论 Cbl?b蛋白在皮肤黑素瘤组织及其细胞株中均高表达。     

肾上腺髓质素在黑素瘤中的表达

目的：检测肾上腺髓质素（adrenomedullin,ADM）在人黑素瘤中的表达。方法：采用免疫组织化学SP法检测ADM在15例黑素瘤、30例色素痣组织标本及人成纤维细胞、黑素瘤细胞系A375中的表达。结果：人成纤维细胞中ADM的表达为弱阳性、A375中ADM表达呈强阳性。黑素瘤组织标本中80％检测到ADM,色素痣组织标本中仅有43．3％检测到ADM的表达,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：肾上腺髓质素在人黑素瘤组织中高表达,在人的色素痣和成纤维细胞中低表达,提示ADM与黑素瘤发生、发展可能密切相关。     

miR-203调控锌指蛋白281表达对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响

【摘要】 目的 初步探究微小RNA-203（miR-203）调控锌指蛋白281（ZNF281）对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响。方法 常规培养人血管内皮细胞系ECV304、人黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2，实时荧光定量PCR检测各细胞系中miR-203表达情况，Western免疫印迹法检测各细胞系中ZNF281蛋白水平。A375、M14细胞分别分为5组：对照组（细胞正常培养）、miR-203模拟物对照组（加入miR-203模拟物阴性对照）、miR-203抑制剂对照组（加入miR-203抑制剂阴性对照）、miR-203模拟物组（加入miR-203模拟物）、miR-203抑制剂组（加入miR-203抑制剂）。实时荧光定量PCR检测各组A375、M14细胞中miR-203的表达，CCK8法检测各组A375、M14细胞增殖活性，Transwell实验检测各组A375、M14细胞迁移数量，Western免疫印迹法检测各组A375、M14细胞中ZNF281蛋白的表达。双荧光素酶验证miR-203与ZNF281的靶向关系。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。结果 与血管内皮细胞系ECV304相比，黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2中miR-203表达水平较低（均P < 0.05），ZNF281蛋白水平较高（均P < 0.05）。与对照组、miR-203模拟物对照组、miR-203抑制剂对照组相比，miR-203模拟物组A375、M14细胞中miR-203水平均显著升高（F = 487.632、68.454，均P < 0.05），细胞迁移数量均显著降低（均P < 0.05），ZNF281蛋白表达均显著降低（均P < 0.05）；miR-203抑制剂组A375、M14细胞中miR-203表达均显著降低（均P < 0.05），细胞迁移数量均显著增加（均P < 0.05），A375细胞中ZNF281蛋白表达显著升高（均P < 0.05），36、48、60、72 h A375细胞增殖活性显著升高（均P < 0.05），24、36、48、60、72 h M14细胞增殖活性均显著升高（均P < 0.05）。miR-203与ZNF281之间存在靶位点。结论 上调miR-203表达可抑制黑素瘤细胞增殖、迁移，下调miR-203表达可促进黑素瘤细胞增殖、迁移，可能通过调控ZNF281的表达实现。     

let-7a微小RNA在黑素瘤中的表达及其对A375细胞增殖的影响

目的 探讨甲醛固定石蜡包埋的黑素瘤组织中let-7a微小RNA（microRNA）的表达情况及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响。方法 选取黑素瘤蜡块13份,先天性色素痣蜡块10份,抽提microRNA,采用茎环引物逆转录为cDNA,然后采用Taqman MGB探针,相应的引物,进行实时荧光定量PCR。继而采用cy3标记的siRNA阴性对照物转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率,最后将let-7a的模拟物转染入A375细胞,MTT实验检测转染后细胞增殖的变化。结果 从石蜡包埋组织中成功抽提出microRNA,而且定量PCR结果显示let-7a在黑素瘤中的表达明显低于色素痣组织（t = 2.364,Ｐ < 0.05）。荧光显微镜下观察siRNA转染效率约80% ~ 90%,hsa-let-7a转染A375细胞后,使其增殖受抑,转染后24 h抑制率达32.7%。结论 let-7a在黑素瘤中表达下降,过表达let-7a可使A375细胞增殖受到抑制,提示其在黑素瘤中可能起抑癌基因样作用。     

CXCR7在常见皮肤恶性肿瘤及其细胞株中的表达及意义

目的 探讨趋化因子受体CXCR7在皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、侵袭性皮肤黑素瘤及其细胞株中的表达及其意义。方法 收集30例皮肤鳞状细胞癌、25例基底细胞癌、30例皮肤黑素瘤的癌组织,采用免疫组织化学方法,检测CXCR7蛋白表达水平。采用RT-PCR、细胞免疫组化方法检测CXCR7在A375、M14、A431、HaCaT细胞株中mRNA及蛋白水平。结果 CXCR7在侵袭性皮肤黑素瘤中表达明显,高表达率为80%（24/30）,皮肤鳞状细胞癌及基底细胞癌分别为26.67%（8/30）、8%（2/25）;皮肤黑素瘤CXCR7高表达率与鳞状细胞癌、基底细胞癌比较,差异均有统计学意义（χ2值分别为17.16和28.36,P值均 < 0.05）。CXCR7 mRNA在A375、M14、A431细胞株中均可检出,其中A375表达最强,而HaCaT细胞不表达;细胞免疫组化显示,仅在A375细胞见棕黄色颗粒着色。结论 皮肤黑素瘤及其细胞株A375高表达CXCR7,其可能参与了其恶性侵袭与转移。     

内皮素受体B在黑素瘤中的表达及内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促生长效应

目的 研究内皮素受体B（ETR－B）在人恶性黑素瘤中的表达及内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促生长效应。方法 采用免疫组化SP法检测ETR－B在黑素瘤组织中的表达，用RT-PCR法检测ETR－B基因在人恶性黑素瘤细胞A375和SK－mel－1中的表达，用MTT比色法检测不同浓度内皮素3对黑素瘤细胞A375的体外促增殖活性。结果 ETR-B在41例恶性黑素瘤和23例色素痣中的阳性率分别为78.05%和8.69%，两组间差异有统计学意义，P < 0.05。15例原位和26例Ⅰ ~ Ⅳ期恶性黑素瘤ETR-B阳性表达率分别为53.33%和92.31%，两组比较，P < 0.05。13例转移性恶性黑素瘤（Ⅲ ~ Ⅳ期）中ETR-B阳性表达率100%，28例未转移者（0 ~ Ⅱ期）的阳性表达率为67.86%，两组比较，P < 0.05。ETR－B基因在人恶性黑素瘤细胞A375和SK－mel－1中均有表达；内皮素3对黑素瘤细胞A375在体外具有很强的促增殖作用，且促增殖能力呈内皮素3浓度依赖性。结论 内皮素3/ETR－B在促黑素瘤细胞生长中有重要作用     

恶性黑素瘤中T-钙粘蛋白的表达

目的:探讨恶性黑素瘤组织中T-钙粘蛋白(T-cadherin)的表达.方法:采用免疫组化SP法对18例恶性黑素瘤组织标本和40例皮肤色素痣组织标本及同一标本的正常表皮、黑素瘤细胞系M14和A375进行T-cadherin的检测.结果:正常表皮均表达T-cadherin,恶性黑素瘤组织中11.1%检测到T-cadherin,皮肤色素痣组织中97.5%检测到T-cadherin(P<0.001),差异有统计学意义;黑素瘤细胞系M14、A375中T-cadherin均呈弱阳性表达.结论:T-cadherin在恶性黑素瘤组织、细胞的表达明显降低或缺失,提示T-cadherin在皮肤恶性黑素瘤的发生、发展中可能起重要作用.     

核蛋白14对黑素瘤新生血管形成的影响及机制研究

目的 分析核蛋白14 （NOP14）对黑素瘤血管形成的影响。方法 收集2016年1月至2018年12月在广州市第一人民医院经病理确诊的40例黑素瘤患者的黑素瘤组织，免疫组化检测NOP14和CD31［以微血管密度（MVD）表示］的表达。将黑素瘤细胞A375和SK-MEL-1细胞分别分为4组，分别转染空载体（空载体组）、NOP14过表达载体（NOP14组）、靶向NOP14的siRNA（siNOP14组）和阴性对照siRNA（siNC组）。荧光定量PCR和Western印迹检测各组NOP14 mRNA和蛋白的表达，Western印迹和ELISA检测细胞及其培养基中血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达。利用Transwell小室构建以上各组A375、SK-MEL-1细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型，利用CCK8、Transwell小室和Matrigel血管拟态实验检测共培养后各组HUVEC的增殖、迁移、侵袭和管腔形成能力。采用线性回归模型分析黑素瘤组织中NOP14表达水平与MVD的关系，多因素方差分析检验细胞增殖活性的差异，其余实验指标的两组之间比较采用独立样本t检验。结果 NOP14高表达组（20例）黑素瘤组织MVD为44 ± 13，中表达组（17例）为58 ± 16，低表达组（3例）为62 ± 11，且NOP14表达和MVD呈负相关（r = -0.525，P = 0.017）。与空载体组相比，NOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著降低（P < 0.05）。与siNC组相比，siNOP14组A375和SK-MEL-1细胞及培养基中VEGF和VEGFR的表达水平均显著升高（P < 0.05）。在A375与HUVEC共培养模型中，与空载体共组相比，NOP14组HUVEC的增殖活性（F = 131.85，P < 0.05）和迁移细胞数［22 ± 5比63 ± 8，t = 7.07，P = 0.002）、侵袭细胞数（14 ± 5比45 ± 10，t = 4.94，P = 0.008）及分支节点数（8 ± 2比14 ± 3，t = 5.06，P < 0.001）均显著下降；与siNC组相比，siNOP14组HUVEC的增殖活性（F = 79.92，P < 0.01）和迁移细胞数（152 ± 30比59 ± 4，t = 5.36，P = 0.006）、侵袭细胞数（134 ± 21比50 ± 8，t = 6.40，P < 0.001）及分支节点数（27 ± 3比15 ± 4，t = 6.10，P < 0.001）显著升高。在SK-MEL-1细胞与HUVEC共培养模型中，各组HUVEC的增殖、迁移和侵袭活性以及管腔形成能力和与各组A375细胞共培养的HUVEC变化趋势一致。结论 黑素瘤组织中 NOP14表达和MVD呈负相关，NOP14具有抑制黑素瘤血管新生的作用。     

沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ，应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系，构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组，经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力，采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力，采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示，相对于癌旁组织，ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825，P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示，shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073，shCtrl组为1.000 ± 0.244，两组比较，t = 9.461，P < 0.001，蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115，t = 8.595，P = 0.002， 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示，shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%，t = 6.464，P = 0.003），且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示，与shCtrl组相比，shATAD3A组划痕愈合减慢，划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%，t = 5.835，P = 0.004）至24 h明显降低，通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139，t = 12.411，P < 0.001）。Western印迹显示，shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达，沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

微小RNA-181b-5p对皮肤黑素瘤细胞株增殖和侵袭的作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨微小RNA（miRNA）-181b-5p是否通过靶向普列克底物蛋白（PLEK）抑制皮肤黑素瘤（CM）细胞的增殖及侵袭能力。方法 生物信息学分析CM核心基因;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181b-5p和PLEK的靶向结合。采用RNA oligo和siRNA分别调控A375细胞miRNA-181b-5p和PLEK的表达,具体分组为：模拟物阴性对照组、miRNA-181b-5p模拟物组、抑制剂阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂组、PLEK siRNA组、siRNA阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂和对照siRNA共转染组以及miRNA-181b-5p抑制剂和PLEK siRNA3共转染组。上述各组用相应试剂处理细胞48 h后,采用qPCR检测A375细胞中miRNA-181b-5p和PLEK mRNA的表达,Western印迹检测PLEK蛋白的表达,Transwell小室侵袭实验检测A375细胞的侵袭能力;继续培养24 ~ 96 h后,CCK8实验检测A375细胞增殖能力。结果 PLEK为CM的核心基因,CM原位癌组织较癌旁组织高表达PLEK（P = 0.031）,转移组织较原位癌组织高表达PLEK（P = 0.001）。与人表皮黑素细胞HEMa-LP相比,A375细胞高表达PLEK mRNA（3.884 ± 0.156比0.997 ± 0.010,t = 18.48,P < 0.001）及PLEK蛋白（2.840 ± 0.301比1.029 ± 0.094,t = 5.47,P = 0.005）,低表达miRNA-181b-5p（0.333 ± 0.042比0.967 ± 0.069,t = 7.83,P = 0.001）。双荧光素酶报告基因实验显示,miRNA-181b-5p和PLEK靶向结合。与模拟物阴性对照相比,miRNA-181b-5p模拟物转染后A375细胞的存活率显著降低（48 h,t = 7.96,P = 0.015;72 h,t = 7.50,P = 0.002;96 h,t = 7.96,P = 0.001）,侵袭能力也显著降低（t = 5.07,P = 0.007）;相反miRNA-181b-5p 抑制剂组A375细胞存活率高于抑制剂阴性对照组（24 h,t =5.38,P = 0.013;48 h,t = 5.36,P = 0.013;72 h,t =7.63,P = 0.005;96 h,t =5.99,P = 0.004）,侵袭能力也高于抑制剂阴性对照组（t = 7.24,P = 0.002）;与对照siRNA组相比,PLEK siRNA转染后A375细胞的增殖能力降低（48、72、96 h时,P值分别为0.015、0.011、0.001）,侵袭能力也降低（t = 4.93,P = 0.008）;与miRNA-181b-5p 抑制剂和对照 siRNA共转染组相比,miRNA-181b-5p 抑制剂和PLEK siRNA共转染组A375细胞的增殖率明显降低（24、48、72、96 h时,P值分别为0.042、0.042、0.037、0.017）,侵袭能力也明显降低（t = 8.52,P = 0.001）。结论 miRNA-181b-5p抑制A375细胞增殖和侵袭能力,其机制涉及靶向下调PLEK的表达。     

miRNA-188-5p表达下调通过调控PTEN/Akt途径抑制皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭能力

【摘要】 目的 探讨miRNA-188-5p（miR-188-5p）在皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）组织和细胞中的表达，分析其表达下调对皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 2012年11月至2018年10月在河南省新乡医学院第一附属医院收集50例手术切除的皮肤鳞癌组织及50例癌旁正常皮肤组织。实时荧光定量PCR（qPCR）检测皮肤鳞癌组织、癌旁正常皮肤组织、皮肤鳞癌细胞系SCL-1、A431、HSC-5和人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞中miR-188-5p的表达。培养的A431和HSC-5细胞分别分为2组：miR-188-5p抑制剂组和阴性对照组，对转染miR-188-5p抑制剂的细胞和阴性对照组细胞，通过qPCR检测miR-188-5p的相对表达（2-△△Ct），并以CCK8法和Transwell小室分别检测各组细胞的增殖活性和侵袭能力。双荧光素酶报告实验检测miR-188-5p和PTEN的相互作用，Western印迹法检测PTEN、总Akt（t-Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）的表达。两独立样本比较采用t检验。结果 皮肤鳞癌组织中miR-188-5p的相对表达（5.213 ± 3.138）显著高于癌旁正常皮肤组织（1.010 ± 0.364，t = 9.187，P < 0.001）。SCL-1、A431和HSC-5细胞中miR-188-5p的表达（3.858 ± 0.163、7.068 ± 0.262和4.572 ± 0.413）均显著高于HaCaT细胞（1.079 ± 0.300，t = 17.890、21.110和8.737，均P < 0.05）。与阴性对照组相比，miR-188-5p抑制剂组A431和HSC-5细胞miR-188-5p表达显著下调（均P < 0.01），细胞增殖和侵袭能力下降（均P < 0.05）。双荧光素酶报告实验显示，miR-188-5p表达下调显著上调A431和HSC-5细胞中PTEN的表达，但抑制p-Akt的表达。结论 miR-188-5p在皮肤鳞癌组织和细胞中高表达，且miR-188-5p表达下调可能通过调控PTEN/Akt途径，抑制皮肤鳞癌细胞增殖活性和侵袭能力。     

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨恶性黑素瘤（MM）组织中泛素结合酶2S（UBE2S）的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法 应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织（8份瘤旁组织、8份正常表皮组织）芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM?2B及MUM?2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM?2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染, 72 h后实时定量PCR检测 A375和MUM?2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann?Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果 UBE2S在98例（51.0%）MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义（χ2 = 11.905,P＜0.01）;UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关（ρ = -0.210,P = 0.043）。A375、MUM?2B、MUM?2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义（F = 817.228,P＜0.01）。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞（t = 17.572,P＜0.01）与干扰组MUM?2B细胞（t = 24.552,P＜0.01）分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高（t = 7.365,P＜0.01）,而S期比例明显降低（t = -9.190,P＜0.01）,G2/M期无明显变化（t = -0.227,P＞0.05）;干扰组MUM?2B细胞G1期（t = 12.676,P＜0.01）、G2/M期（t = 13.045,P＜0.01）细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组（t = -15.718,P＜0.01）。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移（t = -35.727,P＜0.05）及侵袭（t = -125.000,P＜0.01）能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论 UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。     

核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

【摘要】 目的 研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达，及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过 qRT-PCR分析 E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s）和色素痣细胞中的表达，免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞，通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。结果 7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞（均P < 0.001）。qRT-PCR显示，皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达（0.000 55 ± 0.000 17）高于色素痣组织（0.000 18 ± 0.000 09，t = 3.22，P < 0.001）。免疫组化、Western印迹显示，皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织（均P < 0.001），而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组（均P < 0.001）。相关性分析显示，恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关（免疫组化：r = -0.56，Western印迹：r = -0.63，均P < 0.01）。敲减A375细胞E2F6基因后，E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组（t = 3.38、2.76，P < 0.001）。CCK-8实验显示，继续培养后48 h，E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组（t = 4.58，P < 0.01）；软琼脂平板实验显示，E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组（t = 2.26，P＜0.001）；迁移实验显示，E2F6抑制组穿出小室细胞数（165 ± 23）低于对照组（376 ± 22，t = 3.14，P < 0.01）；侵袭实验显示，E2F6抑制组穿出小室细胞数（96 ± 11）低于对照组（315 ± 31，t = 2.12，P < 0.01）；3D细胞培养实验显示，E2F6抑制组细胞形态发生明显变化，侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示，E2F6抑制组G0 - G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组（均P < 0.001）。Western印迹显示，E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组（P < 0.001），P21蛋白水平高于对照组（P＜0.001）；E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组（P < 0.001），而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组（P < 0.001）。结论 核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达，敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。     

泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA慢病毒载体构建及其对A375细胞生物学行为的影响

目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒载体,探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA,构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组,即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组,阴性对照组（阴性对照shRNA转染）,空白对照组（转染空载体）。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率;CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力;流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期,Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体,Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明,CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低（均P < 0.01）。流式细胞仪检测示,CBLB-shRNA-3组凋亡率［（22.73 ± 6.58）%］明显高于阴性对照组［（6.08 ± 1.35）%］和空白对照组［（6.34 ± 1.07）%,均P < 0.01］。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P < 0.01）,而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P < 0.01）。Transwell检测示,阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14,差异有统计学意义（F = 794.50,P < 0.01）。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体,其可促进A375细胞凋亡,抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。     

短发夹RNA干扰STAT3基因对恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 研究短发夹RNA（shRNA）沉默STAT3基因表达对人恶性黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的作用。 方法 设计和构建靶向STAT3基因有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后克隆入psiRNA-hH1neo质粒,使用脂质体转染A375。实验分为对照组、空载体组和STAT3转染组。通过RT-PCR和Western印迹检测A375细胞中STAT3 基因mRNA和蛋白表达水平,MTT比色法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期分布,观察细胞凋亡。结果 STAT3转染组A375细胞STAT3 mRNA和蛋白表达水平（分别为0.2136 ± 0.0626、0.8214 ± 0.0430）明显低于对照组（0.7826 ± 0.0701、3.1693 ± 0.0846）和空载体组（0.8518 ± 0.0783、3.2180 ± 0.0780）,P值均 < 0.01。STAT3转染24、48、72 h组的细胞增殖抑制率明显增高（分别为21.35% ± 2.12%、32.52% ± 2.64%、40.40% ± 3.08%）,与正常对照组（1.39% ± 0.53%、3.05% ± 1.16%、4.41% ± 1.42%）、空载体组（2.63% ± 1.38%、5.84% ± 2.47%、10.32% ± 2.48%）比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）。流式细胞仪检测显示,STAT3转染组细胞的凋亡率（81.06% ± 2.10%）较对照组（26.28% ± 0.47%）和空载体组（27.31% ± 1.05%）明显增高,差异有统计学意义（P < 0.01）。细胞周期分析显示,STAT3转染组G0 / G1期细胞比例（68.43% ± 4.00%）增高,S期细胞比例（17.40% ± 2.05%）降低,与对照组（分别为60.07% ± 2.47%、28.40% ± 2.09%）及空载体组（分别为60.29% ± 2.26%、27.34% ± 3.63%）相比,差异有统计学意义（P < 0.01或 < 0.05）。结论 针对STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒能够下调STAT3 基因和蛋白表达,抑制A375的增殖能力,诱导细胞凋亡。     

siRNA沉默肾上腺髓质素基因对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）沉默肾上腺髓质素（ADM）基因对黑素瘤细胞系A375增殖和凋亡的影响。方法 实时荧光定量-PCR（qRT-PCR）检测干扰效果,并选出干扰效果最好的siRNA。用筛选出的最有效siRNA转染A375细胞为实验组;转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。免疫细胞化学法蛋白水平检测干扰效果;噻唑蓝法（MTT）分别测定沉默ADM基因 24、48 h后A375细胞增殖的变化;流式细胞仪（FCM）检测干扰ADM基因48 h后A375细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR显示ADM-siRNA-2干扰效果最好。免疫细胞化学结果显示转染ADM-siRNA-2后ADM蛋白的表达显著低于未转染组和阴性对照组。MTT结果显示,转染ADM-siRNA-2的细胞24、48 h吸光度A值为0.389 ± 0.0375,0.469 ± 0.0330,低于空白对照组 （ 0.574 ± 0.0733、0.685 ± 0.0154）和阴性对照组（0.548 ± 0.0376、0.676 ± 0.0374）,差异均有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。FCM检测显示转染ADM-siRNA-2组的细胞早期凋亡率为（20.200 ± 6.046）%,高于空白对照组（1.667 ± 0.340）%和阴性对照组（4.587 ± 1.294）%,差异有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。结论 siRNA沉默ADM基因对A375增殖有抑制作用;而对凋亡则有明显促进作用。