两种突变特异性抗体用于肺腺癌EGFR基因突变的评价

目的:验证EGFR 19del E746-A750和21L858R突变抗体的灵敏度和特异性以及免疫组织化学与RTPCR方法的一致性,并探讨免疫组化在肺腺癌EGFR基因突变状态评价中的应用。方法:采用免疫组织化学方法对139例经过RT-PCR验证EGFR基因突变状态的病例进行检测。并采用SPSS19.0软件对两种方法的检测结果进行一致性分析。结果:与RT-PCR结果相比,EGFR del E746-A750和L858R突变抗体的总体敏感性为78.5%,特异性为93%。分别分析EGFR del E746-A750和L858R特异抗体,前者的敏感性和特异性分别是64.3%和97.8%,后者为90.3%和95.2%。采用SPSS19.0软件进行Kappa检验显示免疫组化和RT-PCR的结果高度一致。结论:EGFR del E746-A750和L858R突变抗体具有良好的灵敏度和特异性,结合全自动免疫组化仪进行EGFR基因突变检测是一种经济便捷可靠的方法。     

建立一种N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术

目的 建立一种简便、省时、有效的N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术.方法 对比“凸背”引物荧光PCR新技术和Sanger测序法:通过对混有不同比例的N-ras基因热突变G13D(GGT＞GAT)质粒的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度;对97例急性髓细胞白血病(AML)患者的外周血的DNA进行N-ras的G13D突变检测,统计两者的符合率. 结果 “凸背”引物荧光PCR新技术能检测出混有5％突变质粒型的样本,其灵敏度达5％,高于Sanger测序法的10％ ～ 20％.在97例AML患者的外周血的DNA中,“凸背”引物荧光PCR新方法和Sanger测序法检测到N-ras基因G13D突变分别为19例和18例,符合率达94.7％. 结论 “凸背”引物荧光PCR新技术比测序法更为快速、简单,有更高的灵敏度,容易实现.     

MALDI-TOF-MS高灵敏度分析EGFR基因多位点突变方法的建立与应用

目的 以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)为分析平台,建立表皮生长因子受体(EGFR)基因多位点突变的高灵敏度同步检测方法,用于辅助临床伴随诊断。方法 使用MALDI-TOF-MS推荐的网站设计引物和单碱基延伸引物(UEP),设计添加针对野生型基因组的blocker,以减少野生型模板对突变位点检测的干扰。用数字PCR定量标准品,使用定量后的标准品验证检测体系的灵敏度。收集228例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的血液标本,比较MALDI-TOF-MS平台与微滴式数字PCR(ddPCR)平台检测结果的特异度、灵敏度。结果 MALDI-TOF-MS检测E746＿A750del位点、T790M位点突变灵敏度达0.1%,最小突变检出拷贝数达2.8;L858R位点突变灵敏度达0.5%,最小突变检出拷贝数达12。与ddPCR检测相比,MALDI-TOF-MS检测E746＿A750del、L858R和T790M位点的灵敏度、特异度、Kappa值分别为94.4%(34/36)、99.5%(191/192)、0.95,94.6%(35/37)、100.0%(191/191)、0....     

建立一种HBV突变检测的蝎子实时荧光PCR新方法

目的：为 HBV 突变检测建立一种有效、快速、简捷的蝎子实时荧光 PCR 新方法。方法同时用蝎子实时荧光 PCR 新方法和 Sanger 测序法对比：对157例 HBV 患者的血清的 DNA 进行 HBV 基因rtN236T 突变检测,统计其符合率;通过对混有不同比例的 HBV 基因 rtN236T 突变核酸的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度。结果在157例 HBV 患者的血清样本中,蝎子实时荧光PCR 新方法检测到 rtN236T 突变的有69例,而 Sanger 测序法检测的有68例,其符合率为98.6％;蝎子实时荧光PCR 新方法能检测出混有5％突变的样本,其灵敏度达5％,比 Sanger 测序法高。结论蝎子实时荧光 PCR 新方法能有效检测到 HBV 突变,且比 Sanger 测序法更为简单、快速、灵敏度高,适合临床应用。     

一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立一种KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并初步探讨其临床应用价值。方法以KRAS基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物,利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品,建立KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,并进行方法学和应用评估。结果成功构建了KRAS基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,该方法灵敏度高（9．39×10^1copies／uL）,重复性好（实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1．60％、2．54％）。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品,结果符合率为100％。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法。     

荧光实时定量PCR检测肺癌组织表皮生长因子受体基因突变的临床应用价值——附71例分析

目的:建立1种检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变的荧光实时定量PCR的新方法,并探讨应用这种方法检测肺癌组织EGFR基因突变的临床应用价值.方法:通过自行设计探针及引物,应用荧光实时定量PCR方法,检测71例女性非小细胞肺癌患者的肺癌组织中EGFR基因的第19号和第21号外显子上的突变情况,并与直接测序法比较.结果:中国女性非小细胞肺癌的病人中EGFR基因的突变率为30%(21/71);荧光实时定量PCR与直接测序法的特异度符合率是95%(20/21),敏感度符合率是100%,检测时间为直接测序法的1/12,而且结果判读直观.结论:应用荧光实时定量PCR检测肺癌组织中的EGFR基因特定位点的突变是一种快速、可靠的方法,具有较高的临床应用价值.     

LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血靶点表皮生长因子受体(EGFR)基因L858R位点突变的快速筛查方法。方法在Genebank上查找EGFR 21号外显子(L858R)的DNA序列,利用Primer Explorer V4软件设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并对其特异性和敏感性进行评价。采集11例临床病理诊断为NSCLC患者外周血血浆,以聚合酶链反应(PCR)扩增结果为标准,对建立的LAMP方法的准确性进行验证。结果采用自行设计的LAMP引物及构建的反应体系可特异性扩增EGFR L858R位点突变阳性DNA,检测敏感性为0.1%,特异性达到100%。LAMP法在11例EGFR L858R位点突变阳性的NSCLC患者血浆标本中检测到9例阳性。结论成功建立了LAMP检测人外周血浆EGFR基因突变方法,诊断敏感性、特异性和准确性均较高,可荧光目测判读检测结果,是一种简单、快速的EGFR基因突变筛查方法。     

应用基因扫描方法快速检测EGFR基因19外显子缺失突变

目的:应用基因扫描法检测人表皮生长因子受体(EGFR)基因19外显子缺失突变.方法:(1)将EGFR基因19外显子缺失(delE746-A750)型及野生型基因分别克隆到T载体.并将含突变型基因及含野生型基因的载体按1:1、1:5、1:10、1:50、1:100、1:300的比例进行混合,用基因扫描法检测19外显子的缺失,以确定其灵敏度.(2)基因扫描法检测225例非小细胞肺癌患者的手术组织或穿刺标本:荧光标记EGFR基因19外显子的上游引物,PCR扩增目的片段,3100A测序仪进行基因扫描.Gene Scan Genotyper3.5软件分析结果.同时用直接测序法检测EGFR 19外显子的缺失突变.结果:(1)基因扫描法可测出1:100混合液中的突变型,灵敏度较高.(2)225例肺癌标本,可检测出27例(12.0%)缺失:直接测序法则检出25例(11.5%)缺失突变.结论:基因扫描法检测EGFR基因19外显子的缺失,方法简便,成本低廉,敏感度高,可查出1%的突变.     

实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的总结分析

目的:采用实时荧光定量PCR法检测临床送检的非小细胞肺癌(NSCLC)标本中表皮生长因子受体(EGFR)基因的突变情况,分析其突变率、突变特征及其与临床病理间的相关性。方法:将101例石蜡包埋NSCLC标本行显微切割后抽提DNA,采用实时荧光定量PCR法检测EGFR基因酪氨酸激酶编码区第19和21号外显子的突变。结果:101例NSCLC标本中共检出EGFR基因第19号、第21号外显子突变21例(20.8%),突变率分别为61.9%(13/21)和38.1%(8/21),其又以19 del-E746-A750和21 L858R为主要突变类型,发生率分别为42.9%(9/21)和38.1%(8/21)。EGFR基因总突变率与年龄无关(P>0.05);但女性患者中EGFR基因突变率(27.3%,12/44)高于男性患者(15.8%,9/57;P     

非小细胞肺癌接受埃克替尼治疗进展后继发性T790M突变

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者接受埃克替尼治疗进展后的继发性T790M突变情况。方法:应用突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system,ARMS)方法检测209例EGFR 19del或L858R突变NSCLC患者接受埃克替尼治疗进展后T790M突变状态,并分析临床特征。结果:209例NSCLC样本中,19del有123例,L858R有86例,接受埃克替尼治疗耐药后检测T790M突变型患者占45.93%(96/209),耐药后T790M突变与19del/L858R之间差异有统计学意义(P0.034)。结论:EGFR常见突变的NSCLC患者,19del患者接收埃克替尼治疗后更易出现T790M突变,应予以重视。     

广东地区非小细胞肺癌EGFR基因的突变研究

目的 探讨广东地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者中EGFR基因的突变情况.方法 用微分离富集肿瘤细胞,采用QIAGEN DNA提取试剂盒提取基因组DNA,通过PCR扩增及DNA测序技术分析非小细胞肺癌患者中EGFR基因突变情况.结果 43例非小细胞肺癌中,有22例(51.2%)存在EGFR基因的突变,其中13例为外显子...     

胰腺癌中EGFR、KRAS、BRAF基因突变状况分析及意义

目的:检测胰腺癌组织EGFR、KRAS、BRAF基因突变状况,为胰腺癌EGFR靶向治疗研究奠定基础.方法:提取胰腺癌及胰腺良性病变石蜡组织切片中基因组DNA,PCR扩增EGFR 18、19、21外显子片段,KRAS2、3外显子片段,BRAF15外显子片段,采用直接测序法检测其突变状况.结果:32例胰腺癌患者中有24例患者存在KRAS基因突变,10例良性病变组织均未发现突变,两者差异具有统计学意义(x2=14.57,P=1.35× 10-4),其中22例12密码子突变(G12D14例,G12V8例);2例61密码子突变(Q61L).所有检测样本中未见BRAF突变.共3例EGFR突变,其中包括1例19外显子突变(de1746-750),2例21外显子突变(L858R),10例良性病变组织未见突变.结论:在胰腺癌中KRAS基因突变可能为EGFR通路失调的主要原因,其次是EGFR突变,BRAF突变未见.     

蝎子PCR法与传统测序法检测K-ras基因突变的比较

目的建立一种简单、便捷、有效检测K-ras突变的蝎子PCR新方法.方法同时用蝎子PCR法和Sanger测序法对87例结直肠癌组织的K-ras基因进行热突变型G12D(GGT>GAT)进行检测,统计其符合率.结果87例结直肠癌组织样本中,蝎子PCR法和Sanger测序法检测到同样9例G12D突变,其符合率为100%.结论蝎子PCR法能有效检测到K-ras突变,且比Sanger测序法更为简便、快速,适合临床应用.     

高通量测序在非小细胞肺癌基因突变研究中的应用

目的对非小细胞肺癌(NSCLC)精准化诊疗相关的28种肿瘤驱动基因进行高通量测序,分析多基因突变与疾病临床特征的关系。方法收集重庆大学附属肿瘤医院2017年1月至2018年10月396例NSCLC患者标本,对EGFR、ALK、ROS1、KRAS、NRAS、HRAS、PIK3CA、TP53、PTEN、BRAF、HER2、RET、MET等28种基因进行高通量测序分析。结果EGFR基因突变占基因突变总检出例数的35.35%,且基因突变频率最高的前5个基因占总突变的63.89%,表现出明显的肿瘤主基因突变聚集现象。EGFR基因亚型同样呈明显的主次分布规律,其中最常见的突变亚型是19del、L858R,分别占45.00%、41.43%。EGFR基因的19del、L858R和20ins 3个亚型多为单突变,而T790M、G719X、S768I、L861Q等亚型则常表现为共突变。T790M伴随L858R突变常常是原发性突变,T790M与19del共突变则常常是获得性突变。EGFR突变标本发生其他多基因突变的检出率显著低于无EGFR突变标本,可能是因为EGFR基因突变抑制了其他基因发生突变。结论高通量测序可高效检测NSCLC患者与靶向治疗相关驱动基因的突变情况,可为研究多基因突变的内在关系及突变负荷提供有效工具,为临床医生制订NSCLC患者的精准诊疗方案提供有力支撑。     

运用高灵敏度COLD-PCR法检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变

目的 评价COLD-PCR法检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变的价值.方法 采用COLD-PCR/Sanger测序法与普通PCR/Sanger测序法检测KRAS基因野生型结直肠癌细胞系SW116中混有的KRAS基因突变型和结直肠癌细胞系SW480中的KR4S基因突变,确定两种方法 的灵敏度,并采用两种方法 分别检测20例胰腺癌和39例结直肠癌患者石蜡包埋组织的KRAS基因突变,并评价两种方法 的符合率.结果 细胞系检测结果 显示,普通PCR/Sanger测序法和COLD-PCR/Sanger测序法检测KRAS基因突变的灵敏度分别为1∶20和1∶100(突变型:野生型).COLD-PCR/Sanger法检测20例胰腺癌患者KRAS基因突变率[75%(15/20)]高于普通PCR/Sanger测序法[40%(8/20),x2=5.013,P<0.05];COLD-PCR/Sanger测序法检测39例结直肠癌患者的KRAS基因突变率[44%(17/39)]高于普通PCR/Sanger测序法[31%(12/39),x2=1. 372,P=0.174)].两种方法 检测胰腺癌标本的符合率为65%,但一致性较差(Kappa=0.364,P<0.05);而两种方法 检测结直肠癌标本的符合率为87%,且一致性较好(Kappa=0.730,P<0.05).结论 COLD-PCR/Sanger测序法是一种高灵敏性检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变的方法 .     

Rapid polymerase chain reaction-based detection of epidermal growth factor receptor gene mutations in lung adenocarcinomas

Somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene are present in lung adenocarcinomas that respond to the EGFR inhibitors gefitinib and erlotinib. Two types of mutations account for approximately 90% of mutated cases: short in-frame deletions in exon 19 and a specific point mutation in exon 21 at codon 858 (L858R). Screening for these mutations has been based mainly on direct sequencing. We report here the development and validation of polymerase chain reaction-based assays for these two predominant types of EGFR mutations. The assay for exon 19 mutations is based on length analysis of fluorescently labeled polymerase chain reaction products, and the assay for the exon 21 L858R mutation is based on a new Sau96I restriction site created by this mutation. Using serial dilutions of DNAs from lung cancer cell lines harboring either exon 19 or 21 mutations, we detected these mutations in the presence of up to approximately 90% normal DNA. In a test set of 39 lung cancer samples, direct sequencing detected mutations in 25 cases whereas our assays were positive in 29 cases, including 4 cases in which mutations were not apparent by sequencing. These assays offer higher sensitivity and ease of scoring and eliminate the need for sequencing, providing a robust and accessible approach to the rapid identification of most lung cancer patients likely to respond to EGFR inhibitors.