登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒前-X蛋白在大肠埃希菌中的表达及多克隆抗体的制备

目的在大肠埃希菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白,纯化、鉴定并制备多克隆抗体。方法通过PCR技术获得HBV前-X编码基因片段,克隆至载体pET32a( ),构建原核表达重组质粒,转化至大肠埃希菌中诱导表达,表达产物进行Ni 亲和层析纯化,经Western blotting证实该蛋白的免疫原性,然后免疫新西兰兔获得多克隆抗体并经ELISA实验测定效价,经Western blotting证实其免疫反应特异性。结果成功构建原核表达载体并在大肠埃希菌中高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,融合蛋白的相对分子量约为25kD,Western blotting结果表明目的蛋白具有特异性的免疫反应识别。成功获得前-X蛋白的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为>1:128000,Western blotting实验证实获得的抗体能发生特异性免疫反应。结论成功完成了HBV前-X蛋白的体外表达及多克隆抗体制备,为检测前-X蛋白在乙型肝炎患者体内的表达及进一步研究其生物学特性奠定了实验基础。     

肿瘤-睾丸抗原CT45-5的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：原核表达、纯化肿瘤-睾丸抗原CT45-5基因,并制备多克隆抗体,以研究其在Fhit特异的信号通路中的作用。方法：设计出特异针对CT45-5的引物,通过RT-PCR扩增出CT45-5的编码基因,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果：原核表达和纯化了CT45-5,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的CT45-5蛋白。结论：肿瘤-睾丸抗原CT45-5能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究CT45-5的功能奠定了基础。     

抗SARS冠状病毒N蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白的多克隆抗体。方法以纯化的GST-N免疫新西兰白兔,制备抗SARS-CoVN蛋白多抗,间接ELISA法检测兔血清效价,Westernblot和免疫组化鉴定多抗的特异性。结果制备的抗SARS-CoVN蛋白多克隆抗体经ELISA检测效价为1·2×10-5,Westernblot和免疫组化证实此抗体可与SARS-CoVN蛋白特异性结合。结论成功地制备了抗SARS-CoVN蛋白多抗,为进一步的临床诊断和实验研究创造了条件。     

人细胞外基质磷酸糖蛋白MEPE的表达纯化及抗体制备

目的 原核表达、纯化人细胞外基质磷酸糖蛋白(Mepe)基因,并制备多克隆抗体.方法 设计出扩增人Mepe全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性.结果 原核表达了人Mepe全长基因,纯化了MEPE蛋白,并获得了抗MEPE的多克隆抗体,抗体效价达到1∶25 600,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的MEPE蛋白.结论 MEPE蛋白能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础.     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a( )表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在E.coli中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础。方法根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a( )载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a( )并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性。结论该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。     

人载脂蛋白A～Ⅰ的基因克隆﹑原核表达及多克隆抗体的制备

目的获取人载脂蛋白A～Ⅰ(ApoA～Ⅰ)的重组蛋白,并用于多克隆抗体的制备。方法从人肝细胞(LO2)中提取总RNA后,经RT～PCR法得到人ApoA～Ⅰ基因片段,用以构建融合表达载体pGEX～6P～1～ApoA～Ⅰ的重组质粒;将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,用异丙基硫代～β～D～半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST～ApoA～Ⅰ包涵体蛋白,通过蛋白复性和纯化后免疫小鼠得到多克隆抗体,并用ELISA法检查其效价。结果经PCR扩增出的ApoA～Ⅰ基因片段(746bp)与理论值大小基本一致。SDS～PAGE(十二烷基磺酸钠～聚丙烯凝胶电泳)以及West-ern blotting(蛋白印迹分析)验证纯化后的蛋白质分子量与质谱分析数据相符。免疫小鼠所得的免疫血清通过ELISA显示其抗体效价也具有高度特异性。结论成功地在大肠埃希菌中诱导表达出了ApoA～Ⅰ,蛋白质通过纯化免疫小鼠,得到了特异性的多克隆抗体。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a( )上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a( )-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。     

霍乱弧菌外膜蛋白W的原核表达及抗原性分析

目的在大肠杆菌中表达霍乱弧菌种特异性外膜蛋白（Omp）W,纯化后制备检测用OmpW抗体。方法采用PCR法以霍乱弧菌基因组为模板扩增ompW基因,插入表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-32a-ompW;重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导获得目的蛋白,纯化后免疫新西兰大耳白兔,制备OmpW的多克隆抗体并进行鉴定。结果扩增得到ompW基因片段,并成功构建pET-32a-ompW原核表达系统,重组蛋白OmpW以包涵体形式高效表达;制备的OmpW抗体能与天然的O1群和O139群霍乱弧菌结合。结论霍乱弧菌OmpW可由原核系统高效表达,免疫获得的抗体具有较好的效价,为进一步制备霍乱弧菌检测用抗体奠定基础。     

利用免疫蛋白质组学鉴定炭疽杆菌蛋白MetK及其免疫原性验证

目的验证免疫蛋白质组中鉴定到的S-腺苷甲硫氨酸MetK蛋白的免疫原性。方法免疫蛋白质组学的方法鉴定到MetK蛋白,通过PCR方法扩增metK基因全长,然后将其克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌DH5α,测序正确后提取质粒转入BL21（DE3）中进行诱导表达。再通过Ni-NTA柱纯化MetK蛋白,纯化后的蛋白免疫SPF级的BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,通过多克隆抗体与炭疽芽孢杆菌A16R全菌蛋白Western印迹检测,验证MetK蛋白的免疫原性。结果与结论成功表达了MetK蛋白,制备了其多克隆抗体,为免疫蛋白质组学鉴定到的蛋白点进行验证,也为研究MetK蛋白的生物学功能研究提供了条件。     

金黄色葡萄球菌糖肽水解酶LytM及其C端的表达、纯化与功能研究

目的利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）糖肽水解酶LytM及其C端185～316 aa蛋白（LytM185～316）,检测其生物学活性,并制备多克隆抗体,为检测LytM活性体的天然形式和产生机制以及研究LytM蛋白在SAU感染中的生物学意义奠定基础。方法以SAU 8325-4基因组为模板,PCR扩增lytM及其C端基因,并将其克隆入pET-28a构建重组表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导阳性克隆表达目的蛋白,通过亲和纯化获得目的蛋白LytM及LytM185～316,并制备LytM的多克隆抗体;用薄层层析法测定LytM以及LytM185～316的生物活性,并检测重组蛋白对SAU 8325-4菌体的裂解作用。结果成功构建了表达载体pET-28a-LytM和pET-28a-LytM185～316,获得了纯度较高的重组蛋白LytM及LytM185～316,经测定LytM不能够水解底物而LytM185～316具有较强的糖肽水解酶活性。制备了高效价的抗LytM的多克隆抗体,并证实其可以与LytM及LytM185～316特异性结合。结论只含有C端185～316 aa的重组蛋白能够水解底物,而全长的LytM不具有糖肽水解酶活性。     

小鼠源性ABIN1蛋白的抗体制备及功能验证

目的制备小鼠源性A20结合核因子κB活化抑制蛋白1（A20 binding inhibitor of NF-κB activation 1,mABIN1）的多克隆抗体并进行功能验证,利用该抗血清对大鼠脑区ABIN1的分布进行验证。方法利用mABIN1片段与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）耦联得到的肽段为免疫原,免疫新西兰大耳白兔3次,共35 d,获得抗血清,分别用ELISA、蛋白免疫（Western）印迹和免疫组织荧光化学法对抗体的特异性进行验证;使用上述验证所得的特异性抗血清,通过Western印迹检测ABIN1在大鼠各脑区的分布;对所得到的特异性抗血清进行纯化。Western印迹证明,纯化后的抗体杂带较纯化前明显降低,但效价也有所下降。结果与结论成功制备了兔抗小鼠ABIN1抗血清并对抗血清进行纯化,经该抗血清首次验证ABIN1在大鼠嗅球、皮质、海马、纹状体、伏隔核、丘脑、下丘脑、小脑、脑干及脊髓等中枢神经系统不同部位均有广泛分布,为在动物体内进行ABIN1生物学功能研究提供了有利工具。     

H5N1型流感病毒M1蛋白的基因克隆与表达

目的：克隆、表达A型H5N1流感病毒基质蛋白M1,为研制新的流感快速检测方法奠定基础。方法：应用PCR方法扩增M1的全基因序列,克隆至PET32a载体上,经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21（DE23）,经IPTG诱导表达M1蛋白后,对其表达产物进行SDS-Page和Western Bloting分析。结果：SDS-Page电泳显示M1蛋白在BL21（DE23）大肠杆菌中成功表达,Western Bloting分析显示表达产物可以与M1多克隆抗体发生特异性反应。结论：成功克隆和表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,为进一步制备高滴度单克隆抗体、研制新的流感检测方法奠定了基础。     

功能未知基因LOC410296的表达载体构建及小鼠抗血清制备

目的：为深入研究功能未知基因LOC401296,首先获取其全长序列,实现LOC401296分子的真核和原核表达,并制备针对 LOC401296蛋白的抗血清。方法采用 PCR 方法克隆 LOC401296编码区全长序列,利用pET28B和pCMV-Myc质粒构建LOC401296原核表达和真核表达载体,用异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白原核表达,目的蛋白经纯化、复性后免疫小鼠制备抗血清。结果 PCR克隆得到LOC401296编码区全长序列,成功构建LOC401296原核及真核表达载体,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌体内表达,用纯化蛋白免疫小鼠获得抗人LOC401296蛋白血清, ELISA检测抗血清效价达1∶64000,Western印迹证实LOC401296真核表达载体成功表达且抗血清特异性良好。结论获得LOC401296基因编码区全长序列,成功构建了LOC401296基因表达载体,分别在大肠杆菌和真核细胞内实现LOC401296蛋白原核表达和真核表达,获得小鼠抗人LOC401296蛋白抗血清,为LOC401296基因功能研究奠定了基础。     

基于HPV16的新型伪病毒对DNA特异性B细胞的杀伤研究

目的构建基于人乳头状病毒（humanpa pilloma virus,HPV）16型的新型伪病毒,并检测其对DNA特异性B细胞（R4A）的杀伤效应。方法利用昆虫杆状病毒表达系统表达病毒蛋白,在体外变性与复性过程中将病毒蛋白包装B细胞特异性启动子Igκ控制下的白喉毒素（Diphtheriatoxin,DT）A链（DT-A）基因表达型质粒DNA,形成伪病毒。转染R4A细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测其杀伤效应,酶联免疫法检测R4A细胞分泌抗ds-DNA抗体的滴度。结果转染R4A细胞48h后,荧光显微镜和流式细胞仪成功检测到新型伪病毒对R4A细胞的杀伤效应,R4A细胞分泌抗ds-DNA抗体的滴度明显降低。结论基于HPV16的新型伪病毒能有效特异杀伤R4A细胞,并降低抗ds-DNA抗体的滴度,为系统性红斑狼疮的治疗提供了理想的策略。     

艰难梭菌毒素AC端结构域在大肠杆菌中的可溶性表达与卵黄抗体的制备

目的重组表达艰难梭菌毒素A的C端结构域,制备针对艰难梭菌毒素A C端结构域的卵黄抗体。方法将优化合成的艰难梭菌毒素A的C端结构域DNA片段克隆到表达载体pET32b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌中诱导表达,经高亲和镍离子树脂纯化得到融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。检测目的蛋白的生物学活性,用目的蛋白免疫产蛋鸡制备针对艰难梭菌毒素A受体结合区的鸡卵黄抗体,分离纯化鸡卵黄抗体并用ELISA测定卵黄抗体的效价。结果获得了优化的艰难梭菌毒素A受体结合区的基因片段,继而制备了具有生物学活性的毒素A C端结构域重组蛋白。免疫产蛋鸡后获得了效价1∶50 000的抗艰难梭菌毒素A的卵黄抗体。结论获得了具有生物学活性的艰难梭菌毒素A C端结构域重组蛋白,为建立艰难梭菌基因工程疫苗打下了基础,并制备了针对艰难梭菌毒素蛋白A的卵黄抗体,可用于艰难梭菌相关性腹泻的诊断和治疗。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

A20结合核因子抑制蛋白的抗体制备及鉴定

目的获得A20结合核因子抑制蛋白（A20 binding inhibitor of NF-κB activation,ABIN1）的多克隆抗体。方法利用钥孔虫戚血蓝蛋白（KLH）偶联肽段为抗原免疫新西兰兔,获得抗血清。分别用ELISA、免疫荧光法和Western印迹检测对抗体进行鉴定。结果与结论成功制备出兔抗人ABIN1抗血清,为进一步研究ABIN1的生物学功能提供了工具。