杆状病毒介导内耳基因治疗的实验研究

目的 探讨重组杆状病毒作为内耳基因治疗载体的可行性及其转染特点.方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,建立新生大鼠耳蜗Corti 器体外模型,加入携带报告基因的病毒悬液,观察外源基因表达情况,并将其通过圆窗直接显微注射进入豚鼠内耳,观察杆状病毒在体内的转染特点.结果 Bac-GFP联合丁酸钠可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞, 但并没有改变Corti器的正常结构.体内试验显示杆状病毒可以忠实和长效转染螺旋神经节细胞,而未被补体系统灭活.结论 实验证实杆状病毒有希望成为内耳基因治疗的新型载体.     

重组杆状病毒载体介导报告基因在甲状腺癌细胞中的表达研究

目的 探讨杆状病毒作为甲状腺癌基因转移和治疗载体的可行性.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统制备携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组杆状病毒(Bac-GFP).分别以不同感染复数(MOI)的Bac-GFP感染滤泡状甲状腺癌细胞株FTC-133,流式细胞仪鉴定感染效率及GFP表达强度.以MOI为100的Bac-GFP感染FTC-133,荧光显微镜观察GFP表达持续时间;流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠干预对感染效率及GFP表达强度的影响.MTT比色法检测不同MOI的Bac-GFP感染对FTC-133细胞存活的影响.结果 成功制备重组杆状病毒载体Bac-GFP并感染FTC-133.感染效率随MOI的增加而提高;当MOI为100时,感染效率高达71.3%.丁酸钠可提高Bac-GFP对FTC-133的感染效率及GFP表达强度,但感染效率的提高无统计学意义.荧光显微镜观察显示,Bac-GFP感染FTC-133其GFP表达可持续2周.MTT检测显示,不同MOI的Bac-GFP感染FTC-133的细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 重组杆状病毒Bac-GFP对FTC-133细胞具有较高的感染效率.报告基因表达时间较长且无明显细胞毒性,有可能成为甲状腺癌基因治疗的良好载体.     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点.方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MO1的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系.通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度.结果发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2 d最高,至少可持续9 d.Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异.结论重组杆状病毒可以用于体外基因转导.     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。     

IL-10基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究

目的:探索局部应用IL-10基因与慢病毒重组载体对实验性自身免疫性感音神经性聋(ASNHL)的治疗作用。方法:采用纯化同种内耳抗原免疫豚鼠,造成ASNHL动物模型,再将重组载体分别经鼓阶、内淋巴囊和圆窗龛局部注射或渗透,观察听觉功能和内耳病理形态学变化,同时行免疫组织化学试验了解慢病毒转染和基因产物在内耳的分布。结果:治疗前后ABRⅢ波阈值的均值对比分析结果显示,各实验组局部基因治疗后均降低;治疗后各实验组组间比较差异无统计学意义。慢病毒主要转染部位是血管纹、Corti器、蜗轴小血管周围及其内淋巴囊等处。基因产物表达部位与转染部位基本相同。结论:重组载体经不同途径均可转导入内耳,并在内耳表达基因产物,对ASNHL发挥有效的治疗作用。     

自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究

目的:研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的Fas配体(Fas-Ligand,即FasL)基因和白细胞介素10(即IL-10)基因治疗实验性自身免疫性感音神经性聋.方法:采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠,造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型28只,按配对设计将其分为4组,通过鼓阶微量注射的方式,A组注入携带FasL基因的腺病毒(Ad-FasL),B组注入携带IL-10基因的腺病毒(Ad-IL-10),C组单纯注入腺病毒(携带绿色荧光蛋白,即Ad-GFP),D组注入等量的磷酸盐缓冲液.基因导入7 d后行听觉脑干诱发电位(ABR)测试,后取颞骨制作石蜡切片并行HE染色和光镜观察,每组各取两耳行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察.每组各取3只(6耳)行免疫荧光和酶免疫组织化学试验,以检测基因产物表达和腺病毒转染情况.结果:免疫组织化学显示携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞,并产生相应的蛋白产物(IL-10和FasL).ABRⅢ波阈值的均值对比结果显示,A组和B组明显低于C组和D组.内耳组织的免疫炎性反应亦明显较C组减轻.结论:重组复制缺陷型腺病毒可以携带目的基因转导入内耳,并在内耳表达基因产物,其抑制炎症反应的作用可有效地减轻自身免疫性感音神经性聋的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍,有望成为治疗自身免疫性感音神经性聋新的方法和途径.     

内耳干细胞分离培养及鉴定的实验研究

目的：明确内耳干细胞的取材、培养方法及鉴定方法,观察内耳干细胞的形态.方法：取前庭椭圆囊处上皮;大鼠内耳内螺旋沟;内耳的Corti器位置;利用无血清培养和单细胞克隆技术,进行细胞培养,在相差显微镜下观察细胞形态及生长状况,并用Nestin、Brdu免疫荧光方法,鉴定内耳干细胞.同时进行细胞计数.结果：从新生大鼠内耳分离的组织,经原代和传代培养后,可获得大量未分化,悬浮生长的Nestin阳性细胞团,并具有增殖的能力,免疫荧光实验可表达Brdu阳性.其中内耳的Corti器位置取材组Nestin阳性细胞团的直径和其他两组存在统计学差异.而打散后的细胞团中Brdu阳性细胞数量较多,是内耳干细胞的最佳取材位置.结论：从新生大鼠前庭椭圆囊处上皮、大鼠内耳内螺旋沟、内耳的Corti器位置可分离出内耳干细胞,其中内耳的Corti器是内耳干细胞的最佳取材位置.     

日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定

目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的重组杆状病毒载体。方法 将目的基因（EGFP和GDNF）克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达。结果 目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达。结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染Sf9细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础。     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的重组杆状病毒载体.方法 将目的 基因(EGFP和GDNF)克隆人杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达.结果 目的 基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达.结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染SD细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础.     

重组杆状病毒载体介导报告基因在甲状腺癌细胞中的表达研究

目的探讨杆状病毒作为甲状腺癌基因转移和治疗载体的可行性。方法利用杆状病毒Bac—to—Bac表达系统制备携带绿色荧光蛋白（GFP）的重组杆状病毒（Bac—GFP）。分别以不同感染复数（MOI）的Bac—GFP感染滤泡状甲状腺癌细胞株FTC-133,流式细胞仪鉴定感染效率及GFP表达强度。以MOI为100的Bac—GFP感染FTC-133,荧光显微镜观察GFP表达持续时间;流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠干预对感染效率及GFP表达强度的影响。MTT比色法检测不同MOI的Bac—GFP感染对FTC-133细胞存活的影响。结果成功制备重组杆状病毒载体Bac—GFP并感染FTC-133。感染效率随MOI的增加而提高;当MOI为100时,感染效率高达71．3％。丁酸钠可提高Bac—GFP对FTC-133的感染效率及GFP表达强度,但感染效率的提高无统计学意义。荧光显微镜观察显示,Bac—GFP感染FTC-133其GFP表达可持续2周。MTT检测显示,不同MOI的Bac—GFP感染FTC-133的细胞存活率比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论重组杆状病毒Bac—GFP对FTC-133细胞具有较高的感染效率,报告基因表达时间较长且无明显细胞毒性,有可能成为甲状腺癌基因治疗的良好载体。     

杆状病毒载体介导钠碘转运体基因放射治疗肝癌的实验研究

目的 探讨以杆状病毒为载体、钠碘转运体(NIS)基因介导131I放射治疗肝细胞癌的可行性.方法 通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组的绿色荧光蛋白(GFP)和NIS基因杆状病毒(Bac-GFP和Bac-NIS).采用流式细胞仪检测在有无丁酸钠条件下HepG2细胞的感染效率和荧光表达强度,以及在高感染复数(Mol)杆状病毒条件下对HepG2细胞的毒性.进行Bac-NIS 感染HepG2细胞的动态摄碘实验和高氯酸钠(NaClO4)摄碘抑制实验,以及Bac-NIS感染HepG2细胞的131I杀伤细胞克隆形成实验.结果HepG2的感染效率和荧光强度随着Bac-GFP MOI的增加而增加,Bac-GFP对HepG2具有较高的感染效率(MOI=200时,感染效率为65％),丁酸钠可进一步提高HepG2的感染效率.在高MOI(MOI=400)条件下,未见Bac-GFP对HepG2的细胞毒性作用,与对照组(MOI=0)比较差异无统计学意义(P＞0.05).Bac-NIS感染的HepG2细胞表现出摄碘功能和NaCIO4抑制的特性.细胞克隆形成实验表明,Bac-NIS感染的HepG2细胞克隆存活率明显低于Bac-GFP感染的HepG2细胞,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Bac-NIS可有效介导肝癌细胞的碘摄取,高效杀伤肿瘤细胞,为肝癌细胞的靶向基因放射治疗提供了实验基础.     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法

目的：报道一种新的基因治疗方法。方法：将人全长血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＴＰＯ）基因克隆至ｐＢａｃＭａｍ２载体,与ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００病毒ＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９细胞,经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒,以此为载体,将人ＴＰＯ基因导入小鼠体内。结果：获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株,动物实验外周血小板计数升高至正常的２～３倍,ＲＴＰＣＲ结果显示ＴＰＯ在小鼠组织中得到表达。结论：重组ｒｈＴＰＯ昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体。     

蚯蚓纤溶酶PI_(239)基因在杆状病毒中的表达

利用基因重组技术将PI2 39基因通过细菌 /杆状病毒 (Bac to Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体 ,载体采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 ,将重组病毒转染昆虫Sf9细胞 ,细胞出现明显病变。SDS PAGE电泳可以见到相对分子质量 3 .0万位置有蛋白表达 ,免疫印记结果表明该条带可以与PI2 39抗体反应。提示蚯蚓纤溶酶PI2 39重组蛋白已经获得表达 ,为进一步研究蚯蚓纤溶酶PI2 39基因的生物学活性奠定了基础     

基于hNIS基因的辐射正反馈重组杆状病毒体系制备

目的构建含早期生长应答因子1（Egrl）辐射敏感启动子调控的人钠碘同向转运体（hNIS）基因重组杆状病毒，为进一步延长核素在细胞中的滞留时间，提高hNIS介导的恶性肿瘤放射性核素基因靶向治疗疗效提供理论基础。方法空载体pFB取自质粒pFB—CMV—EGFP，Egrl启动子取自质粒PGL3一Egrl—luc，hNIS取自质粒pcDNA3．1一CMV—hNIS，构建重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—Hnis；同时构建含CMV启动子的质粒pFB—CMV—hNIS作为阳性对照，并将杆状病毒空载体质粒pFB-0作为阴性对照。随后制备各组杆状病毒，扩增收集重组杆状病毒并进行滴度测定。为进一步鉴定病毒功能，一方面通过体外感染U87脑胶质瘤细胞并采用131I刺激，通过免疫荧光检测131I刺激后的hNIS蛋白表达；另一方面通过摄碘实验进一步验证所表达的hNIS蛋白的摄碘功能和特性。结果成功构建重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—hNIS和pFB—CMV—hNIS；转座成功并提取了重组Bacmid；重组Bacmid转染Sf9细胞后扩增收集的重组杆状病毒滴度可以达到1×1010pfu／mL。体外感染U87细胞后，免疫荧光检测表明131I刺激后可增加hNIS的表达，感染细胞表达的hNIS蛋白位于细胞膜上，且具有摄碘的功能。结论成功构建了重组杆状病毒载体质粒pFB—Egrl—hNIS及pFB—CMV—hNIS，获得高滴度的重组杆状病毒Bac—Egrl—hNIS、Bac．CMV—hNIS和Bac-0并得到验证；建立了基于hNIS基因的辐射正反馈重组杆状病毒体系，为进一步提高核素靶向治疗疗效奠定了重的理论基础。     

人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达

目的：分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因K12，克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法：设计一对引物，在引物的5’端分别引入。BamH1、EcoRI酶切位点，以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV～8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVLl393中，构建成重组K12杆状病毒转移载体pVL-K12，并与线性：BaculoGold病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平；间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果：含HHV-K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达，经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论：杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。     

小鼠肝炎病毒N蛋白基因在杆状病毒中的表达

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠肝炎病毒N基因. 方法 根据GenBank发表的小鼠肝炎病毒A59株N基因序列（AY700211）,设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出N基因的ORF,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体pFastBHa-N.将重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-N.通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9. 结果 获得了重组杆状病毒rBN,并通过Westernblot和IFA分析表明证实N蛋白在昆虫细胞中获得正确表达,且表达产物具有抗原性. 结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠肝炎病毒N蛋白,为进一步进行建立诊断学方法的研究奠定了基础.