海藻糖负载对人红细胞冷冻干燥保存影响的实验研究

目的初步探讨红细胞冻干长期保存的有效方法,并比较冻干前海藻糖的负载与否对红细胞冻干保存效果的影响。方法实验设实验组(负载海藻糖冻干-复水后红细胞):37℃,红细胞负载海藻糖7h后,采用主要成分为含有15%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和150mmol/L,海藻糖的缓冲液作为保护液,在设定的降温程序下冻干保存红细胞;对照组:未负载海藻糖冻干-复水后红细胞。冻干结束后用37℃的再水化液快速水化,检测2组的各项理化指标。结果实验组红细胞冻干再水化后RBC和Hb回收率要高于对照组(P<0.05);ATP酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢镁(G-6-PD)活性水平显著差异有统计学意义(P<0.05))。结论胞内海藻糖对红细胞冻干具有明显的保护作用,红细胞在37℃孵育7h的条件负载海藻糖后冻干-复水后能保持细胞的理化稳定性。     

人红细胞冻干后复水条件的初步研究

本研究旨在探讨不同复水条件对冻干红细胞回收率的影响，为冻干红细胞复水条件的优化提供实验依据。在一系列不同条件下，包括复水溶液、复水温度、复水阶段红细胞胞体积变化速率（即蒸汽预复水）等，对冻干红细胞进行复水，检测红细胞复水后回收率并检测冻干红细胞复水后各项理化功能的改变。结果显示：在复水液配方中以PBS为基液配制的10％（w／v）PVP40溶液效果较好。在复水温度方面，低于37℃时红细胞回收率随着温度的升高而增加，42℃比37℃略差，37℃下复水效果最好。在加入复水液之前将样品放置在37℃的饱和蒸汽环境中预复水能提高红细胞回收率并使细胞体积和体积分布宽度更接近于新鲜细胞数值。复水后红细胞理化性质的检测显示，红细胞的变形性较常规保存的红细胞有所下降，但胞内ATP酶、G-6-PD酶、SOD和2，3-DPG的活性降低较少，酶活性回收率大于红细胞回收率。结论：人红细胞冻干后最佳的复水条件是：冻干红细胞在37℃的饱和蒸汽环境中预复水，复水液为PBS＋10％PVP40，复水温度为37℃，但对冻干复水过程中的细胞膜的保护还需进行更深入的研究。     

红细胞冻干保存前对海藻糖的负载

目的探寻红细胞负载海藻糖的有效方法,评价负载海藻糖对红细胞各项理化指标的影响。方法设实验组(负载海藻糖红细胞)和对照组(未负载海藻糖红细胞),使用硫酸-蒽酮法测定胞内海藻糖含量,检测负载后红细胞各项理化指标,通过流式细胞术检测负载后红细胞膜的完整性。结果在37℃条件下,红细胞对海藻糖的摄取随胞外海藻糖浓度的增加而增多,当海藻糖浓度为800mmol/L,水浴7h,红细胞负载海藻糖可达到有效浓度;且2组红细胞各项理化指标比较差异无统计学意义(P>0.05);流式结果显示红细胞在高渗环境中负载海藻糖后,细胞膜结合很少量Annexin-V-FITC,并且破损细胞能被有效清除。结论红细胞37℃孵育7h,胞外海藻糖浓度为800mmol/L,能有效摄取海藻糖,且保持红细胞的理化稳定性和膜结构完整性。     

人红细胞冻干前负载海藻糖最佳化研究

为更好的实现海藻糖在红细胞冻干保存中的保护作用,关键是克服质膜对海藻糖的非渗透性,使胞质内海藻糖达到有效浓度。本研究的目的是通过对人红细胞负载海藻糖的规律性研究,筛选出海藻糖负载的最佳负载条件并评价海藻糖负载对红细胞各项理化指标的影响。在不同孵育温度(4、22和37℃)、孵育时间(0、2、4、6、8、10小时)、不同负载缓冲液浓度(0、200、400、600、800、1000mmol/L)条件下检测新鲜红细胞对海藻糖的成功负载量及红细胞各项理化指标;在固定负载条件下,对新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞海藻糖负载、游离血红蛋白(FHb)、血红蛋白(Hb)和红细胞平均体积(MCV)进行了比较。结果表明:红细胞对海藻糖的负载与孵育温度、时间及负载缓冲液海藻糖浓度密切相关。随着温度的升高、时间的延长和负载缓冲液海藻糖浓度的增加,红细胞对海藻糖的摄取量也随之增加。在海藻糖负载最佳条件下,新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞的胞内海藻糖浓度、FHb浓度分别为65.505±6.314mmol/L、66.2±5.002mmol/L和6.567±2.568g/L、16.168±3.922g/L。结论:红细胞负载海藻糖的最佳条件是采用新鲜红细胞,在37℃条件下、海藻糖浓度为800mmol/L的负载缓冲液中孵育8小时,这一条件可使胞内海藻糖达到有效浓度,并保持红细胞细胞理化性质稳定和膜完整性。     

不同冻干保护体系对海藻糖负载红细胞冻干保存影响的研究

本研究旨在评价冻干保护剂人血白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘油对海藻糖负载后红细胞冰冻干燥保存的影响,筛选最佳冻干保护体系。将浓缩红细胞在37℃,浓度为800 mmol/L的海藻糖溶液中孵育7 h,经PBS液冲洗3遍后制成海藻糖负载的浓缩红细胞。对照组为海藻糖负载红细胞不添加保护剂,直接冻干;实验组将人血白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等组成的冻干保护体系与海藻糖负载浓缩红细胞混合,两组样品在常温下平衡30 min,移入-80℃深低温冰箱,预冻24 h,入冻干机冻干处理24 h。用温度为37℃,6%羟乙基淀粉40注射液快速再水化样品,用氰化血红蛋白试剂盒测定血红蛋白溶血率,计算血红蛋白回收率,同时测定干燥样品含水量。结果表明：当样品含水量在3%-4%时,对照组冻干红细胞血红蛋白回收率为（33.57±2.89）%,白蛋白组血红蛋白回收率为（51.15±1.98）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。选用不同浓度的葡聚糖为冻干保护剂,血红蛋白回收率较对照组明显降低,随浓度增加,血红蛋白回收率逐渐升高,当浓度为36%时,血红蛋白回收率为（22.15±4.12）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）组成的冻干保护体系,当浓度小于40%时,血红蛋白回收率明显低于对照组,差异有显著性意义（P〈0.05）。10%甘油组血红蛋白回收率为（3.93±1.80）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：人血白蛋白在海藻糖负载的冻干红细胞中发挥重要保护作用,葡聚糖与浓度小于40%PVP可削弱细胞内海藻糖的保护作用。液态的甘油不宜作为红细胞冰冻干燥保存的保护剂。     

海藻糖、蔗糖、葡萄糖负载红细胞对冻干红细胞影响的比较

目的探讨细胞内的海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞的影响。方法以海藻糖、蔗糖、葡萄糖、PBS作负载液,将红细胞置各负载液中孵育37℃、7h,然后冻干红细胞。再水化后测定血红蛋白回收率及红细胞内ATP含量,评价海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞的影响。结果冻干后血红蛋白回收率:负载海藻糖、蔗糖及葡萄糖的红细胞明显高于PBS负载红细胞(P<0.001),海藻糖与蔗糖负载明显优于葡萄糖负载(P<0.001),海藻糖与蔗糖负载的红细胞无明显差异(P>0.05)。冻干后细胞内ATP含量:葡萄糖负载红细胞明显高于海藻糖及蔗糖负载红细胞(P<0.001),负载海藻糖高于负载蔗糖(P<0.05)。可认为负载海藻糖、蔗糖及葡萄糖的红细胞冻干后,细胞内的ATP水平葡萄糖组最高,海藻糖组其次,蔗糖组最低。结论细胞内的海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞均有保护作用,综合血红蛋白回收率及红细胞内ATP含量,海藻糖较蔗糖及葡萄糖保护作用更好。     

冻干血小板再水化后稳定性的实验研究

目的 探讨冻干血小板再水化后的稳定性变化。方法 使用血细胞计数仪测定冻干血小板再水化后细胞计数回收率，以及在室温条件下随放置时间的不同，胞内外海藻糖浓度变化的趋势。结果 冻干血小板再水化后，细胞计数回收率在8h内保持稳定。胞外海藻糖浓度为30mM和1％人血清白蛋白混合物，可使冻干血小板回收率显著提高（P〈0．01）。结论 负载海藻糖的冻干血小板再水化后8h内仍保持较好的稳定性，海藻糖可使冻干再水化血小板的稳定性显著提高。     

细胞内外海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响

目的研究细胞内海藻糖对红细胞冻干保存后血红蛋白回收率及ATP水平影响。在一定条件下负载红细胞,细胞内海藻糖浓度保持恒定,研究细胞外不同浓度的海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响。方法将浓缩红细胞在37℃,浓度为800 mmol的海藻糖溶液中孵育7 h,制成海藻糖负载的浓缩红细胞,对照组为PBS负载浓缩红细胞,行冻干保存,测定Hb回收率及细胞内ATP水平。将PBS液、浓度为50 mmol、200 mmol、400 mmol的海藻糖溶液与海藻糖负载浓缩红细胞按1∶1比例混匀,行冻干保存及再水化,用氰化血红蛋白试剂盒测定Hb溶血率,计算Hb回收率。结果经海藻糖负载的红细胞冻干保存,Hb回收率(44.46±5.15)%,细胞内ATP水平(1.91±0.33)μmol/gHb,对照组Hb回收率(7.71±2.71)%,细胞内ATP水平(0.88±0.25)μmol/gHb。2组相比较,P0.05,差异有统计学意义。细胞外PBS液组Hb回收率为(10.36±0.97)%,50 mmol海藻糖组,Hb回收率为(33.57±2.89)%,200 mmol海藻糖组,Hb回收率为(38.64±0.54)%,400 mmol海藻糖组,Hb回收率为(18.10±1.9)%。对照组PBS液组与50 mmol组、200 mmol组、40 0mmol组分别比较,差异有统计学意义。400 mmol组与200 mmol组、5 0 mmol组分别比较,差异有统计学意义(P0.01)。200 mmol组与50 mmol组相比较,差异无统计学意义。结论细胞内的海藻糖大大提高冻干红细胞Hb回收率且可保持冻干红细胞正常ATP水平。细胞外的海藻糖对红细胞冻干保存有保护作用,随着细胞外液中海藻糖浓度增加,冻干红细胞Hb回收率减少。     

冻干前人红细胞对海藻糖的负载影响因素研究

目的研究影响海藻糖负载多种因素,探讨人红细胞对负载海藻糖的影响因素及规律性。方法根据红细胞海藻糖的负载量衡量,利用硫酸-蒽酮法检测红细胞在不同胞外海藻糖浓度、不同孵育时间、不同孵育温度的条件下对海藻糖的摄取量,并检测红细胞溶血程度。结果红细胞内海藻糖在负载液中的浓度<1000 mmol/L、负载时间<9 h、负载温度<37℃条件下,海藻糖的摄取量呈正相关。在负载液中浓度为0、200、400、600、800、1000mmol/L时,红细胞内海藻糖浓度分别为0、10.03、14.5、41.7、55.3和71.6 mmol/L;在温度为37℃时红细胞在浓度为1 000 mmol/L负载液中分别孵育0、1、3、5、7、9 h,胞内海藻糖浓度分别为0、5.73、6.11、55.7、和61.2 mmol/L。对温度、时间和胞外海藻糖浓度的统计分析显示,温度对负载后胞内海藻糖浓度的影响最大(P<0.01)。结论37℃、采用新鲜红细胞在海藻糖浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育7 h能有效摄取海藻糖,使之达到对红细胞起到冻干保护作用的胞内海藻糖理论浓度。     

大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景:细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据.目的:用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成.材料:体质量150 g左右成年SD大鼠.海藻糖由Sigma公司提供.方法:通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4℃、4～37℃(相转变)和37℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件.将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1℃/min的速率降温至-80℃后移入冷冻干燥机中进行冻干.将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照.以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植.主要观察指标:海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况.冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况.结果:海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P<0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著.孵育温度为37℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4℃组(P<0.05),相转变组与37℃组差异无统计学意义.皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P<0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加.实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤.冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状.水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别.冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤(P<0.05).冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d.结论:海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件.     

预冻温度和冻干机搁板温度对冷冻干燥红细胞的影响

为研究预冻温度和冷冻干燥机 (冻干机 )搁板温度对红细胞冻干保存后回收率的影响 ,采用主要成分为7%二甲亚砜和 4 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)的缓冲液作为保护液 ,在不同预冻温度或搁板温度下进行红细胞的冻干保存。首先将新鲜血液离心、洗涤和平衡以制备浓集红细胞 ,然后将浓集红细胞和保护液按 1∶3混匀制备红细胞悬液 ,在不同温度 (- 2 0 ,- 35 ,- 4 5 ,- 80或 - 196℃ )下预冻后移入冻干机 (搁板温度设为 - 35℃ ,抽真空压力为2 0 0mbar)内进行真空干燥。为研究冻干机搁板温度对冻干红细胞的影响 ,将上述红细胞悬液先在 - 80℃下预冻后移入冻干机 ,在不同的搁板温度 (- 2 0 ,- 2 5 ,- 30 ,- 35 ,- 4 0或 - 4 5℃ )下抽真空干燥 ,冻干结束后用 37℃的再水化液快速水化。结果表明 :在不同预冻温度下 ,冻干后红细胞和血红蛋白的回收率均在 85 %和 75 %以上 ,各组之间差异不显著。但 - 196℃组上清游离血红蛋白浓度显著高于其他各组 (P <0 .0 1) ;当搁板温度等于或高于- 2 5℃时 ,样品无法冻干 ;当搁板温度等于或低于 - 30℃时 ,随着搁板温度的降低 ,冻干时间相应延长。再水化后红细胞和血红蛋白回收率均在 90 %以上 ,各组之间差异不显著 ;但当洗涤至等渗时 ,4组血红蛋白回收率之间差异不显著。结论 :本冻     

海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存中的效果比较

目的 比较海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存过程中对细胞的保护效果。方法 将浓缩红细胞、含有不同浓度海藻糖或蔗糖的30％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按照1:3(V/V)的比例混合,-80℃冰箱中预冻1h,入冻干机内冻千处理后,用37℃等渗缓冲液快速水化洗涤样品,然后将其分为3个处理组:组1为30％PVP组(简称PVP组),组2、3为含有5％、10％和15％海藻糖或蔗糖的30％PVP组(简称海藻糖组或蔗糖组),测定各项指标。结果 冻干红细胞再水化后,海藻糖组的细胞回收率[(18.86±4.63)％、(21.73±7.32)％和(18.01±4.53)％]显著低于PVP组[(45.97±11.77)％](P<0.01);蔗糖组,蔗糖浓度为5％、10％时,细胞回收率分别为(37.40±2.90)％和(37.77±4.78)％,二者显著低于PVP组(P<0.05),但当蔗糖浓度升至15％时,细胞回收率[(42.54±10.25)％]和PVP组无显著差异;血红蛋白回收率,海藻糖组[(50.00±3.47)％、(40.91±9.09)％和(52.09±7.01)％]显著低于PVP组[(77.27±3.63)％](P<0.05),而蔗糖组和PVP组无显著差异,且显著高于海藻糖组(P<0.05)。洗涤后3组的游离血红蛋白浓度均<1g/L,其余各项指标的对比关系类似于水化后指标。结论 在冻干保护液中添加不同浓度的海藻糖或蔗糖对于提高冰冻干燥保存后红细胞的回收率和血红蛋白浓度作用不明显;但     

不同温度下海藻糖联合葡萄糖负载红细胞后溶血情况

目的探索海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的最适温度,为冷冻干燥红细胞提供基础。方法分别采用0、0.125、0.25、0.5和1mol/L的海藻糖联合葡萄糖在4℃、25℃和37℃负载红细胞6h。然后检测上清液中游离血红蛋白和乳酸脱氢酶含量。结果负载液浓度为1mol/L时,3种温度下的细胞溶血程度较重,即上清中游离血红蛋白和乳酸脱氢酶浓度较高。在浓度低于1mol/L时,25℃负载后,红细胞溶血程度较高。4℃和37℃负载时,上清中游离血红蛋白和乳酸脱氢酶浓度较低。结论在浓度小于1mol/L时,海藻糖联合葡萄糖在4℃和37℃情况下,负载红细胞后对细胞的损伤较小,能够满足冻存的负载要求。     

再水化液因素对冰冻干燥保存后红细胞回收率的影响

目的　寻求一种能有效提高冰冻干燥 (简称冻干 )保存后人红细胞回收率的再水化体系。方法　测定1 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、6 %羟乙淀粉 (HES)、5 %羧甲基淀粉钠 (CMS)、生理盐水、0 75mol/L葡萄糖、等渗缓冲液及高渗缓冲液 (5×Buffer)的晶体渗透压和胶体渗透压 ;将浓缩红细胞和保护液混匀 ,预冻后移入冻干机内作冻干处理 ,冻干完毕后 ,用不同种类或不同温度的再水化液快速水化洗涤样本。结果　人红细胞冻干再水化后 ,6 %HES组、1 0 %PVP组和 5 %CMS组的红细胞回收率分别为 (93.6 5± 6 .1 8) %、(88.80± 9.4 9) %和 (91 .34± 8.1 3) % ,血红蛋白回收率分别为 (93.4 8± 4 .6 7) %、(89.0 2± 4 .6 7) %和 (88.79± 5 .35 ) % ,均极显著高于其他 4组[(1 5 .5 6± 1 2 .0 2 ) %～ (2 7.77± 6 .4 8) % ,(1 7.78± 1 0 .80 ) %～ (4 1 .5 0± 6 .4 3) % ) ](P <0 .0 1 ) ;不同温度的 6 %HES的再水化效果表明 ,再水化后 3个温度组的红细胞回收率无显著差异 ,但 37℃和 2 5℃组的血红蛋白回收率分别为(87.4 8± 5 .84 ) %和 (91 .37± 3.94 ) % ,均极显著高于 4℃组 (73.1 0± 5 .90 ) % (P <0 .0 1 )而且上清游离血红蛋白浓度也显著低于 4℃组。结论　再水化液的胶体渗透压对冻干保存后红细胞的保护作     

保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥保存后回收率的影响

为了研究保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥 (简称冻干 )保存后回收率的影响 ,采用含有 7%二甲亚砜 (v/v)和 2 0 %、30 %、4 0 %或 5 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) (w/v)的缓冲液作为保护液进行保护液的玻璃化测试和红细胞的冻干保存实验。首先检测溶液的玻璃化状态 ,如果冷冻和解冻过程中任一过程出现白色冰晶即为非玻璃化溶液 ;再将浓集红细胞和不同的保护液按比例混匀 ,预冻后移入冻干机内进行冻干处理 ;冻干完毕后 ,快速水化样品 ,测定红细胞回收率、血红蛋白回收率和上清游离血红蛋白浓度 ,然后对冻干后红细胞形态进行电镜观察。结果表明 :2 0 %PVP +7%DMSO和 30 %PVP +7%DMSO在冷冻和解冻过程中都出现白色冰晶 ;4 0 %PVP +7%DMSO在冷冻过程中无冰晶出现 ,但在解冻过程中出现冰晶 ;而 5 0 %PVP +7%DMSO在冷冻和解冻过程中均无冰晶出现。冻干红细胞再水化后 ,4 0 %PVP +7%DMSO的细胞回收率和血红蛋白回收率分别为 (81.36±14 94 ) %和 (77.5 4± 12 .86 ) % ,显著高于其它 3组 (P <0 .0 1) ;另外 4 0 %PVP +7%DMSO的上清游离血红蛋白浓度也显著低于其它 3组 (P <0 .0 1)。研究表明 :随着溶液中PVP浓度的升高 ,溶液的玻璃化程度也随之增加 ,同时冻干 再水化后红细胞的各项指标也随之改善 ,当溶液中PV     

不同负载温度下红细胞内海藻糖和葡萄糖含量比较

目的探索适合海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的温度,为冷冻干燥红细胞提供基础。方法分别采用0mol／L、0．125mol／L、0．25mol／L、0．5mol／L和1mol／L的海藻糖联合葡萄糖在4℃、25℃和37℃负载红细胞6h。然后检测负载红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度。结果4℃和25℃下,海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞后,进入红细胞的海藻糖和葡萄糖含量相差不大。37℃下负载红细胞后,负载入红细胞的海藻糖和葡萄糖含量均较4℃组明显增高。结论37℃下负载红细胞,更有利于海藻糖和葡萄糖进入细胞内,能够满足冰冻干燥红细胞的负载要求。