黄连解毒汤中13种活性成分的HPLC检测及其有效部位的筛选

目的建立黄连解毒汤(HJD)中13个活性成分黄柏碱、绿原酸、木兰花碱、京尼平苷、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A的HPLC检测方法,利用活性成分含量和比例筛选HJD有效部位。方法借助索氏提取器采用系统溶剂提取法将HJD水煎液冻干粉依次经石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、纯净水提取并干燥后获得HJD不同极性部位,将残渣干燥后作为沉淀部位。采用Agilent 1260型高效液相色谱仪建立HJD中13种活性成分的HPLC检测方法,并对HJD及其不同极性部位中活性成分含量进行检测,筛选HJD有效部位。结果成功建立了稳定可靠的HPLC检测方法;HJD中各活性成分含量从高到低依次为京尼平苷、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄连碱、药根碱、表小檗碱、木兰花碱、黄柏碱、汉黄芩素、绿原酸、千层纸素A。与石油醚、醋酸乙酯、水和沉淀部位相比,HJD正丁醇部位中各活性成分总量最高且其比例与HJD全方相近,为HJD有效部位。结论成功建立了HJD中13个活性成分的HPLC检测方法,经筛选HJD正丁醇部位为HJD有效部位。     

生物碱和黄酮类成分在泻心汤复方配伍中的含量研究

 目的建立同时测定泻心汤中黄连碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的方法,并探索配伍对各成分含量的影响。方法采用C₁₈柱,流动相:甲醇-2%甲酸水溶液(0.1%三乙胺)梯度洗脱;流速:1.0 mL·min^-1;柱温:40℃;检测波长:346 nm;不同配伍之间的差异采用SPSS软件进行方差分析。结果建立了同时测定生物碱和黄酮类成分含量的方法,这7个成分在一定浓度范围内线性关系良好,高、中、低质量浓度加样回收率稳定。与单味黄连、黄芩相比,复方中7个成分含量均降低。大黄使黄连碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷和汉黄芩苷含量降低,使黄芩素和汉黄芩素含量增加;黄连使黄芩素和汉黄芩素的含量降低,使汉黄芩苷含量增加,对黄芩苷影响不大;黄芩使黄连碱、小檗碱和巴马汀的含量降低。结论本法准确可靠,重现性好,结果稳定,适合于泻心汤中生物碱和黄酮类成分的分析。不同配伍对各成分含量有影响,其影响非常复杂。     

黄连解毒汤物质基准量值传递分析

目的 阐明黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction,HJD）物质基准的关键质量属性,建立HJD物质基准指纹图谱并测定其中盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄柏碱、黄芩苷、栀子苷含量及其转移率,为后期HJD的复方制剂研究奠定基础。方法 按古代工艺制备15批物质基准,测定出膏率,建立物质基准的HPLC指纹图谱并进行相似度评价,确定共有峰,同法测定物质基准中8种成分的含量,进行饮片到物质基准量值传递分析。结果 15批HJD物质基准平均出膏率为16.02%,指纹图谱共有18个共有峰,与对照指纹图谱的相似度均大于0.9;指认出8个色谱峰分别为盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄柏碱、黄芩苷、栀子苷。各指标成分从饮片到物质基准的转移率分别为盐酸黄连碱0.61%～1.08%,表小檗碱0.14%～0.24%,盐酸巴马汀0.93%～1.52%,盐酸小檗碱4.09%～6.36%,盐酸药根碱0.81%～1.07%,盐酸黄柏碱0.78%～1.06%,黄芩苷7.45%～12.26%,栀子苷0.42%～2.82%。结论 指纹图谱结合出膏...     

组合药物及黄连解毒汤对小檗碱在大鼠脑组织中药动学的影响

目的研究组合药物(小檗碱+黄芩苷+栀子苷)及黄连解毒汤复方对小檗碱在大鼠脑组织药动学的影响。方法 SD大鼠,分为小檗碱(247.39 mg/kg)组、组合药物(小檗碱、黄芩苷、栀子苷,247.39、130.11、113.01 mg/kg)组、黄连解毒汤(3.92 g/kg,小檗碱247.39 mg/kg)组,各组分别ig相应剂量的药物,分别于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h各取6只大鼠,处死取脑组织,UPLC-MS法测定小檗碱在脑组织中的质量浓度。计算各组中小檗碱药动学参数。结果与小檗碱组达峰浓度(Cmax 108.01 ng/g)相比,组合药物组小檗碱的Cmax(368.59 ng/g)显著增加,明显高于黄连解毒汤原方给药中小檗碱的Cmax(31.97 ng/g);组合药物组的AUC0~∞(3 236.60 min·ng/g)远大于小檗碱组的AUC_(0~∞)(2 701.37min·ng/g)和黄连解毒汤组的AUC_(0~∞)(420.34 min·ng/g)。结论与小檗碱组相比,组合药物能促进小檗碱进入脑组织,而黄连解毒汤复方抑制小檗碱进入脑组织。     

基于方证对应理论的黄连解毒汤肠道吸收分析

目的:基于方证对应理论研究正常和脑缺血病理状态下黄连解毒汤中指标成分肠吸收情况的差异性,探讨临床对症治疗脑缺血疾病的合理性。方法:以黄连解毒汤中盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷为检测指标,建立在体单向肠灌流模型,考察不同浓度黄连解毒汤在正常和脑缺血大鼠的肠吸收情况。结果:与正常组比较,不同浓度黄连解毒汤中盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷在脑缺血模型组大鼠不同肠段的肠吸收均有一定程度增加,其中盐酸小檗碱在十二指肠、空肠有显著性增加;黄芩苷在全部肠段的肠吸收均有显著性增加;栀子苷在空肠、回肠、结肠有显著性增加。结论:黄连解毒汤主要药效成分在脑缺血大鼠的肠道吸收情况优于正常组,为该复方临床对症治疗脑缺血疾病的合理性提供实验依据,体现了中医方证对应理论。     

黄连解毒汤抗原代皮层神经元缺氧缺糖损伤的活性部位筛选

目的观察黄连解毒汤(Huanglian Jiedu Decoction,HJD)各部位和指标性成分对大鼠原代皮层神经元缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)再灌注损伤的保护作用。方法采用大孔吸附树脂法分离制备30%、50%、75%和95%乙醇的洗脱物(HJDFE30、HJDFE50、HJDFE75和HJDFEg5),采用反向高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)法测定各部位中指标性成分的含量。建立连二亚硫酸钠诱导的大鼠原代皮层神经元OGD再灌注损伤模型,运用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTr)比色法,观察HJD的4个部位(HJDFE30、HJDFE50、HJDFE75和HJDFE95)和7个指标性成分对神经元活性的影响。结果 HJDFE30主要含有栀子苷;HJDFE50主要含有黄芩苷、巴马汀、小檗碱和汉黄芩苷;HJDFE75主要含有黄芩苷、小檗碱、黄芩素和汉黄芩素。原代皮层神经元OGD 20 min再灌注1 h后,细胞活性降低(P0.01),HJD、HJDFE30、HJDFE50和HJDFE75可提高神经元存活率(P0.05,P0.01)。各指标性成分栀子苷、黄芩苷、黄芩素、巴马汀、汉黄芩苷和汉黄芩素均可提高神经元存活率(P0.05,P0.01)。结论 HJDFE30、HJDFE50和HJDFE75对大鼠原代皮层神经元OGD损伤具有保护作用,是HJD的活性部位。栀子苷、黄芩苷和黄芩素是HJD的主要有效成分。     

黄连解毒汤有效成分对缺氧/复氧时脑微血管内皮细胞的保护作用

目的:研究栀子苷、黄芩苷和小檗碱对大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用。方法:建立离体大鼠脑微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤模型,用1.024,0.512,0.256,0.128,0.064,0.032,0.016,0.008μmol.mL^-1栀子苷,0.224,0.112,0.056,0.028,0.014,0.007,0.003μmol.mL^-1黄芩苷和0.192,0.096,0.048,0.024,0.012,0.006,0.003μmol.mL-1小檗碱分别作用于正常组和模型组细胞。细胞活性用MTT比色法检测。结果:0.128,0.064,0.032μmol.mL^-1栀子苷,0.028,0.014,0.007μmol.mL-1黄芩苷和0.024,0.012,0.006μmol.mL^-1小檗碱能够比较理想的保护缺氧4 h复氧12 h损伤的大鼠脑微血管内皮细胞。结论:适当浓度的栀子苷、黄芩苷和小檗碱等黄连解毒汤主要成分可以保护脑微血管内皮细胞。     

基于UHPLC-MS/MS技术的导赤丸中24个成分定量测定联合化学计量学质量评价

目的 建立UHPLC-MS/MS法同时测定导赤丸中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、盐酸小檗碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酚、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、哈巴苷、哈巴俄苷、木通苯乙醇苷B、芍药苷、连翘酯苷A和连翘苷的含量。方法 采用Phenomenon C₁₈柱（100 mm×2.1 mm,2.6μm）色谱柱;以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱;体积流量0.3 mL/min;柱温40℃;进样量为1 μL;采用电喷雾离子源（ESI）,以多反应监测（MRM）模式正、负离子同时扫描。结果 24种成分在各自的质量浓度范围内线性关系良好（r≥0.997 7）;精密度、稳定性、重复性等均符合方法学要求,平均加样回收率为92.7%～107.9%,RSD均小于6.5%。15批样品中24种成分的平均质量分数在6.834～7 667.200 μg/g,聚类分析、主成分分析结果一致,均可将3个厂家的样品准确划分为3类。结论 所建立的UPLC-MS/MS法24个成分含量测定方法重现性好,简便、准确、稳定,能客观、全面、有效地确定不同生产企业样品中主要成分的差异,可为导赤丸质量评价体系的完善提供依据。     

LC-MS-MS测定黄连解毒汤中3种生物碱在大鼠血清的含量及其药代动力学研究

目的:建立灵敏、特异、准确、可靠的药根碱、巴马汀、小檗碱在大鼠血清中液质联用(LC-MS-MS)分析方法,用于黄连解毒汤中3种生物碱在正常大鼠体内药代动力学研究.方法:优化药根碱、巴马汀、小檗碱及内标延胡索乙素质谱检测条件,确定相关条件并开展方法学考察.正常大鼠灌胃给予黄连解毒汤,经时取血,样品经处理后将该方法用于3种成分的测定.DAS药代动力学软件拟合房室模型,计算药动参数.结果:在ESI(+)离子化条件下采用MRM工作模式,用,m/z 338～322,351.9～308,336-319.8来分别检测药根碱、巴马汀、小檗碱,同时以m/z 356.1～192.1来检测内标延胡索乙素.药根碱在0.2～25μg·L~(-1)、巴马汀、小檗碱在O.4～50μg·L~(-1)呈良好线性关系.3种生物碱在高、中、低3个浓度的准确度、精密度、稳定性等均符合要求.药根碱、巴马汀、小檗碱在正常大鼠体内药动学过程符合一室开放模型.结论:应用LC-Ms-s技术建立了测定药根碱、巴马汀、小檗碱血药浓度的方法,并成功应用于黄连解毒汤正常大鼠体内这3个成分的药动学研究,为中药复方药动学研究提供了可以借鉴的分析方法.     

反相离子对-高效液相色谱法同时测定葛根芩连汤中13种有效成分及其在配伍机制研究中的应用

目的研究葛根芩连汤不同组方中活性成分含量的差异,揭示其药效物质的变化规律,进而从化学层面探究葛根芩连汤的配伍规律。方法采用反相离子对-高效液相色谱法测定葛根芩连汤不同组方配伍中13种有效成分(葛根素、大豆苷元、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、小檗碱、巴马汀、药根碱、黄连碱、甘草素、异甘草苷、甘草酸和甘草次酸)的含量。色谱柱为Diamonsil C_(18)柱(250 mm× 4.6 mm,5μm);流动相为3.5 mmol/L庚烷磺酸钠溶液(含体积分数0.1%甲酸)-乙腈(含体积分数0.1%甲酸),梯度洗脱,体积流量为1 mL/min;检测波长为270 nm;柱温35℃;进样量为20 μL。结果葛根芩连汤中13种有效成分均基线分离、峰形对称,经方法学验证各项效能指标均符合定量分析要求。不同组方配伍中活性成分的含量变化规律:葛根与黄芩、黄连配伍时,葛根中的葛根素与大豆苷元以及黄芩中的黄芩苷含量均显著增加;黄芩、黄连与炙甘草配伍时,其中的黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素和小檗碱等有效成分均有增加,同时甘草中的甘草酸亦有显著增加;全方配伍时各有效成分均有不同程度增加。结论所建立的方法可用于葛根芩连汤及其组方的配伍规律研究。葛根芩连汤全方配伍对葛根与黄芩、黄连及炙甘草中有效成分的溶出均起到促进作用。其中,臣药黄芩、黄连能显著促进君药葛根中有效成分的溶出,起到辅佐君药的作用;而佐使药炙甘草不仅可促进臣药中有效成分的溶出,同时可在一定程度上增强臣药对君药的辅佐作用,起到协调全方、增效减毒的作用。     

Bioanalysis and Pharmacokinetics of Eight Active Components from Huanglian Jiedu Decoction in Rat Plasma by LC-ESI-MS/MS Method

Objective To develop a sensitive and rapid liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry(LC-ESI-MS/MS) method for the simultaneous determination of wogonin, coptisine, berberine, palmatine, jatrorrhizine, phello-dendrine, magnoflorine, and wogonoside in rat plasma and to evaluate the pharmacokinetic characteristics of Huanglian Jiedu Decoction(HJD). Methods LC separation was performed on an Acquity HSS T3 column(100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) using gradient elution with the mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid water. The detection was accomplished by using positive electrospray ionization in multiple-reaction monitoring mode. Plasma samples were pretreated by protein precipitation. Results The method showed a good linearity over a wide concentration range(r2 0.99). The lower limits of quantification were 0.20 ng/mL for coptisine and phellodendrine, 0.48 ng/mL for berberine, 0.10 ng/mL for jatrorrhizine, 0.32 ng/mL for magnoflorine, 0.30 ng/mL for palmatine, and 4.80 ng/mL for wogonin and wogonoside, respectively. The intra- and inter-day precision of the analytes was less than 12.11%, while the accuracy was between-14.46% and 4.86%. The mean recovery of all the analytes ranged from 93.10% to 110.91%. Conclusion This validated method offers the advantages of high sensitivity. It is successfully applied to evaluating the pharmacokinetic properties of HJD.     

黄连-黄芩药对在泻心汤和葛根芩连汤组方配伍中主要成分的含量变化

目的：探索药对黄连-黄芩在泻心汤和葛根芩连汤组方不同配伍情况下其中所含小檗碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量变化。方法：采用HPLC以乙腈-10 mmol·mL^-1甲酸铵溶液（内含0.2%三乙胺,用甲酸调pH到4.00）为流动相进行梯度洗脱。结果：组方中黄芩、大黄、甘草使黄连中小檗碱、巴马汀含量降低,葛根使小檗碱、巴马汀含量增加。组方配伍中黄连使黄芩中黄酮类成分含量降低,大黄和甘草对黄芩苷含量的影响无显著性差异,但使黄芩素、汉黄芩素含量降低;葛根使黄芩苷含量降低,但使黄芩素、汉黄芩素含量增加。结论：该方法可以有效鉴定泻心汤和葛根汤中5种成分,不同配伍对5种有效成分含量有影响增加。     

基于计算机仿真技术的中药水提液中药效物质与共性高分子物质“溶液结构”及相互作用初探——以黄连解毒汤为例

目的：分析淀粉、果胶等共性高分子物质与小分子药效物质的共存状态及相互作用。方法：选择黄连解毒汤模拟液为研究对象,使用计算机仿真技术,对分析物质进行建模、体系能量最小化、计算总体系能量、计算共性高分子单独存在时的能量、计算小分子药效物质单独存在时的能量,分析淀粉、果胶等共性高分子物质与小檗碱、巴马丁、黄芩苷、栀子苷的相互作用关系。结果：淀粉、果胶与小檗碱、巴马汀为相互吸引关系,与黄芩苷为弱相互吸引关系,而与栀子苷则为相互排斥作用;淀粉与小檗碱、巴马丁、黄芩苷、栀子苷的平均相互作用能依次为-32.159,-28.630,-5.974,234.295 kcal·mol^-1,果胶与小檗碱、巴马丁、黄芩苷、栀子苷的相互作用能平均值分别为-19.717,-19.804,-1.067,253.258 kcal·mol^-1;淀粉、果胶和小分子药效物质的分离容易顺序依次为栀子苷 >黄芩苷 >巴马汀 >小檗碱。结论：共性高分子和小分子药效物质间的相互作用由范德华力占主导地位,静电作用较小（3%~15%）,相互作用能的大小和正负值与药效物质的空间位置有关。     

黄连解毒汤中小檗碱及其他成分模拟组合在脑缺血大鼠体内药动学比较研究

目的 比较基于黄连解毒汤原方比例的4种不同模拟组合中主成分小檗碱在脑缺血模型大鼠体内的药动学变化过程。方法 大鼠按体质量分为模型组和假手术组,模型组以线栓法复制大鼠脑缺血模型。每组又分为4个亚组,分别为小檗碱（247.4 mg/kg）组、小檗碱（247.4 mg/kg）＋黄芩苷（190.7 mg/kg）组、小檗碱（247.4 mg/kg）＋栀子苷（149.5 mg/kg）组、小檗碱（247.4 mg/kg）＋栀子苷（149.5 mg/kg）＋黄芩苷（190.7 mg/kg）组。各组分别于ig给药后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、48、72 h 眼眶取血,HPLC法测定小檗碱在大鼠血浆中的浓度变化,绘制药-时曲线,DAS 2.0计算药动学参数。结果 根据统计矩参数,模型组和假手术组小檗碱的吸收顺序均为小檗碱＋栀子苷组＞小檗碱＋栀子苷＋黄芩苷组＞小檗碱组＞小檗碱＋黄芩苷组。结论 针对脑缺血模型,黄连解毒汤中的栀子苷可促进小檗碱的吸收,黄芩苷则对小檗碱的吸收有一定的抑制作用,而三者组合给药后栀子苷可以降低黄芩苷对小檗碱吸收的抑制作用。     

黄连解毒汤提取动态过程及沉淀产生机制的初步研究

目的:运用统计学方法,初步探讨黄连解毒汤提取动态过程中"沉淀物"的产生及机制。方法:采用UV测定其中总生物碱、总黄酮的量,HPLC同时测定小檗碱、药根碱、巴马汀、黄芩苷、栀子苷的量并计算固含率,沉淀率。采用SPSS统计软件评价各指标性成分、沉淀率、固含率之间的相关性。结果:总生物碱中的小檗碱等的量均与总生物碱呈较好的相关性。总黄酮中黄芩苷与总黄酮的相关系数并不高,而总黄酮与栀子苷的相关系数略高;沉淀率与各指标性成分不显示有极高的相关性。固含率与各指标性成分的相关系数相对较大。结论:随提取时间的变化,提取液中以小檗碱为代表的总生物碱及黄芩苷等达到一定浓度后可视为一平衡点或称为沉淀生成的临界点,即可发生反应,生成"沉淀物";由于"沉淀物"的生成,降低了上述成分浓度,破坏了"平衡状态"。药材中相关成分溶出速度增加,同时沉淀物可能部分溶解,达到新的平衡状态。     

基于指纹图谱和多成分含量测定的关黄柏及川黄柏差异性研究

目的 采用HPLC法建立关黄柏及川黄柏药材指纹图谱,并同时测定5种有效成分的含量,评价关黄柏及川黄柏药材的质量差异。方法 运用HPLC法分别建立10批关黄柏药材和10批川黄柏药材指纹图谱,通过对照品比对,对共有峰进行指认,并测定5种有效成分的含量;对关黄柏及川黄柏药材指纹图谱进行相似度评价,并利用主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）方法对关黄柏及川黄柏中差异性成分进行分析。结果 关黄柏和川黄柏药材指纹图谱有6个共有峰,指认出其中5个峰,分别是木兰花碱、盐酸药根碱、小檗红碱、巴马汀、小檗碱。通过PCA和OPLS-DA分析筛得关黄柏与川黄柏的3个差异性标志物,分别为木兰花碱、巴马汀和小檗碱,其中巴马汀的含量差异最显著。结论 该方法能有效分析关黄柏及川黄柏质量的差异性,为关黄柏及川黄柏的质量评价与控制提供参考。     

产地加工炮制一体化与传统黄柏饮片的化学成分比较研究

目的测定产地加工炮制一体化与传统黄柏的化学成分含量,探讨产地加工炮制一体化黄柏饮片的优势。方法采用HPLC法测定产地加工一体化黄柏饮片与传统方法加工黄柏饮片中绿原酸、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸药根碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素和黄柏酮的含量,并对这些成分含量进行比较。结果通过比较上述指标性成分质量分数的总和发现,传统方法加工的生黄柏与盐黄柏饮片分别为3.956 9%和4.525 0%,产地加工与炮制一体化生黄柏与盐黄柏饮片分别为6.074 2%和8.942 2%,可见产地加工与炮制一体化饮片所含的有效成分均优于传统加工的饮片。结论产地加工与炮制一体化黄柏饮片的质量较好,且操作工序简便,值得推广。     

LC-MS/MS测定药根碱、巴马汀和小檗碱在Caco-2细胞的摄取特性

 目的 建立药根碱、巴马汀、小檗碱的LC-MS/MS测定法,研究其在Caco-2细胞上的摄取特性。方法 色谱条件：Phenomenex luna C₁₈柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);乙腈-水(4 mmol·L^-1醋酸铵和0.08%甲酸)为流动相,梯度洗脱;质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI),正离子检测,MRM模式。实验考察药物浓度和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抑制剂环孢素A和维拉帕米对药根碱、巴马汀、小檗碱在Caco-2细胞上摄取的影响。结果 药根碱、小檗碱在0.001 5~0.30 μmol·L^-1（r=0.999 8、r=1.000 0）,巴马汀在0.001 4~0.28 μmol·L^-1（r=0.999 8）内均呈良好的线性关系;药根碱、巴马汀、小檗碱在Caco-2细胞的摄取在一定范围内呈浓度依赖性,表现为被动扩散;P-gp抑制剂环孢素A和维拉帕米可显著增加药根碱、巴马汀、小檗碱在Caco-2细胞上的摄取。结论 该法快速、灵敏、简单。药根碱、巴马汀、小檗碱在Caco-2细胞的摄取存在P-gp的参与,药根碱、巴马汀和小檗碱是P-gp的底物。