survivin和bcl-2双基因敲减对人舌癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:探讨survivin和bcl-2单基因与双基因敲减后对舌癌裸鼠移植瘤成瘤性的影响。方法:将筛选含有转染survivin siRNA-Tca8113;bcl-2siRNA-Tca8113;survivin/bcl-2siRNATca8113;Negative-siRNA-Tca8113细胞及未转染的Tca8113细胞分组进行培养,细胞数调成1×10~7细胞/ml接种于裸鼠左后肢股部,以无菌生理盐水做阴性对照,隔日观察裸鼠肿瘤发生情况,并测量肿瘤大小、体积。接种5周后处死并测量肿瘤体积大小、比较抑制结果及肿瘤组织切片HE染色病理分析。结果:肿瘤形成率显示空白对照、Lipofectamine和Negative-siRNA三组的裸鼠成瘤率100%,生长速度快、瘤体大;单基因敲减组(bcl-2siRNA、survivin siRNA)和双基因敲减组(survivin/bcl-2siRNA)瘤体较空白对照组小,生长速度慢;双基因敲减组成瘤率低(66.6%),注射生理盐水的阴性对照组接种后未出现肿瘤。肿瘤生长曲线显示空白对照、Lipofectamine、Negative-siRNA三组肿瘤生长速度明显快于单基因敲减和双基因敲减组,而双基因敲减组不仅成瘤延长,而且生长速度明显慢于单基因敲减组。肿瘤抑制率显示双基因敲减(84.5%)明显高于单基因敲减(67.6%和69.8%,P<0.05);肿瘤组织HE染色镜下可见:空白对照、Lipofectamine、Negative-siRNA组肿瘤呈浸润性生长,有大片坏死区,survivin和bcl-2基因敲减后的肿瘤组织与周围组织分界较清,未见明显浸润现象,肿瘤组织坏死区较少。结论:survivin和bcl-2基因敲减能有效抑制裸鼠移植瘤成瘤性,双基因敲减对裸鼠移植瘤抑制作用强于单基因敲减。     

RNA干扰survivin基因对Eca-109细胞体内增殖的影响

目的利用RNA干扰抑制Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin沉默后对食管癌细胞Eca-109体内增殖的影响。方法构建靶向survivin基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染Eca-109细胞,建立稳定转染干扰组细胞Eca-109/si-survivin;同法建立阴性对照组细胞Eca-109/si-control,并以Eca-109为空白对照组细胞;通过Western blot检测survivin基因沉默效果;借助裸鼠移植瘤模型分析survivin干扰前后裸鼠成瘤时间及瘤结节质量的改变,比较各组Eca-109细胞的体内增殖速度;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术法检测移植瘤细胞凋亡的变化。结果干扰组细胞survivin蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组细胞survivin蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠平均瘤结节质量显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠的平均瘤结节质量差异均无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的体内增殖。     

慢病毒载体介导siRNA对人喉癌抑瘤作用的实验研究

目的研究慢病毒载体介导siRNA抑制survivin基因表达后对人喉癌hep-2细胞体内增殖能力的影响以及对裸鼠移植人喉癌的抑瘤活性。方法应用裸鼠成瘤实验测定致瘤能力的改变,采用RT-PCR和Western blotting测定干扰后survivin基因及其蛋白的表达水平;流式细胞术检测喉癌细胞凋亡指数和增殖指数。结果靶向survivin基因的siRNA可以有效抑制survivin基因的表达,使survivin-mRNA表达减少60%-85%,蛋白表达减少70%;流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高(P<0.01),降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论RNA干扰survivin基因表达后明显抑制了人喉癌hep-2细胞的体内增殖能力;siRNA介导的survivin基因下调可明显抑制肿瘤细胞在体内的生长。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

龙葵素通过诱导细胞周期G1/S阻滞抑制裸鼠前列腺癌细胞Du145移植瘤生长

目的探讨龙葵素对前列腺癌细胞Du145 裸鼠移植瘤生长的影响及分子机制。方法采用高度恶性的转移前列腺癌 细胞株Du145 作为动物体内实验的模型,裸鼠皮下接种Du145 细胞建立裸鼠皮下瘤模型。1 周后将接种的裸鼠随机分为2 组：龙葵素实验组和生理盐水空白对照组,每3 d 分别向实体瘤中间部位注射0.2 mL龙葵素（50 μg/mL）和生理盐水,观察裸 鼠体内肿瘤生长,3 周后颈椎脱臼处死裸鼠,剥离肿瘤组织,测量肿瘤的重量并根据肿瘤重量计算抑瘤率。实时荧光定量 PCR和Western blotting 技术检测各组裸鼠瘤体细胞周期相关基因mRNA和蛋白表达。Tunel 原位检测各组裸鼠瘤体组织凋 亡情况。结果龙葵素治疗组裸鼠肿瘤成瘤率明显下降,裸鼠瘤体生长速度明显低于对照组（P<0.01）。龙葵素能抑制瘤体 细胞CyclinD1、CyclinE1、CDK2、CDK4 和CDK6 基因mRNA和蛋白的表达,显著升高p21 基因mRNA和蛋白的表达,龙葵素 干预后裸鼠瘤体组织凋亡显著增加（P<0.01）。结论龙葵素可通过调控细胞周期G1/S 关卡促进组织细胞凋亡抑制前列腺 癌细胞裸鼠移植瘤生长。     

靶向survivin基因RNAi沉默表达对恶性胶质瘤细胞侵袭的影响

目的 探讨存活素(survivin)基因对胶质瘤细胞侵袭的影响和可能机制.方法 应用survivin基因小干扰RNA(siRNA)转染处理胶质瘤SNB19细胞后,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测survivin基因mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞集落生长数和侵袭力.采用Western blot 方法检测癌细胞尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)蛋白水平.结果 survivin siRNA转染组细胞的survivin基因mRNA和蛋白水平明显下调.转染组胶质瘤细胞集落生长数和癌细胞穿膜细胞数明显下调,且与浓度相关.转染组癌细胞uPA蛋白水平明显下降.结论 Survivin基因在胶质瘤细胞侵袭中起着重要作用,采用靶向survivin siRNA转染可抑制其侵袭能力.其机制可能与下凋uPA基因表达有关.     

靶向survivin的RNA干扰下调肺耐药相关蛋白逆转肝癌细胞耐药性的研究

背景 survivin和肺耐药相关蛋白（LRP）都与肝癌耐药有关,但二者之间的关系尚不十分明确。本研究的目的是观察在体外和体内survivin表达下调后,对LRP表达的影响以及逆转肝癌耐药的效果。 方法 应用RT-PCR和Western-blotting检测SMMC-7721细胞和SMMC-7721/ADM细胞中survivin的表达。应用MTT检测两种细胞对ADM的敏感程度。靶向survivin的siRNA转染SMMC-7721/ADM细胞,检测survivin的表达变化、SMMC-7721/ADM细胞对ADM的敏感程度的变化以及LRP的表达变化。建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。分别应用靶向survivin的siRNA、不同浓度的ADM以及二者联合对裸鼠肝癌皮下移植瘤进行处理,观察抑瘤效果,并观察全身毒性反应。检测瘤体内LRP的表达变化。两样本均数的比较采用t检验。 结果 SMMC-7721/ADM细胞中survivin的表达强于SMMC-7721细胞（P﹤0.05）。转染靶向survivin的siRNA后,survivin的表达与对照组相比显著下调（P﹤0.05）,肝癌耐药细胞对ADM的敏感程度明显增加,LRP的表达与对照组相比显著下调（P﹤0.05）。裸鼠皮下移植瘤转染靶向survivin的siRNA后,肿瘤体积从第8天起,与对照组相比显著减小（P﹤0.05）。联合治疗组中的裸鼠肿瘤体积与其它各组相比显著抑制（P﹤0.05）。siRNA组和联合治疗组中的裸鼠无明显毒性反应。瘤体内LRP的表达与对照组相比显著抑制（P﹤0.05）。 结论 通过RNA干扰下调survivin的表达,在体外及体内都能够增加肝癌的化疗敏感性,通过抑制LRP的表达使肝癌耐药性发生逆转。     

RNA干扰对人食管癌裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子C表达的影响

目的:观察RNA干扰对人食管癌裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的影响.方法:将转染VEGF-C小分子干扰RNA(siRNA)载体质粒(HX1、HX2和HX3)的EC9706细胞分别注射于裸鼠皮下,以转染无关序列和正常EC9706细胞为对照,SPF环境饲养4周后处死,取移植瘤组织,分别采用RT-PCR和免疫组化SP法检测VEGF-C mRNA和蛋白的表达.结果:5组移植瘤体积、质量及VEGF-C蛋白和mRNA相对表达量差异均有统计学意义(F分别为3.372、3.948、7.621和8.916,P均<0.05).与正常细胞对照组和无关序列组相比,HX1、HX2及HX3转染组移植瘤组织中VEGF-C蛋门及mRNA表达明显降低(P<0.01).结论:VEGF-C siRNA能有效抑制裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF-C mRNA及蛋白的表达.     

环氧合酶-2基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响

目的观察足细胞环氧合酶-2（COX-2）基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响。方法（1）以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象：分为正常对照组、5μl的siRNA组、10μl的siRNA组、15μl的siRNA组。经诱导分化成熟,在干扰48h后用半定量RT-PCR和Westernbolt分别检测COX-2mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平。（2）以10μl的siRNA组作为研究对象,分别设立足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染对照组,用Westernboh检测nephrin蛋白、BAX蛋白及BCL-X1蛋白的表达水平。结果（1）与正常对照组比较,随着干扰浓度的增加,COX-2mRNA及蛋白表达逐渐减少,而足细胞的凋亡率逐渐升高,15μ1的siRNA组凋亡率明显增高。（2）lμlCOX-2siRNA转染组nephrin蛋白表达显著低于阴性转染组（P〈0．05）。（3）与阴性转染组相比,10IxlCOX-2siRNA转染组Bax蛋白表达显著上调,而Bcl-xl蛋白表达稍有下调。结论敲低COX-2的基因表达可以导致足细胞凋亡,并随着干扰浓度的增加,足细胞凋亡率逐渐增加;在干扰浓度为10μl时,足细胞nephrin蛋白的表达下调;BAX蛋白上调及BCL-X1蛋白下调参与了足细胞的凋亡。     

靶向PTTG和survivin基因共干扰质粒对U251细胞的沉默效率

的：探讨共干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA对U251细胞人垂体瘤转化基因（PTTG）和生存素（survivin）基因表达的影响。方法：U251细胞分为5组,分别为正常细胞对照组、Lipo2000+ 〖JP〗pGenesil-2.1 HK组(HK阴性对照组)、Lipo2000+pGenesil-2.1-PTTG siRNA、Lipo2000+ pGenesil-2.1- survivin siRNA及Lipo2000+pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA。应用RT-PCR法、流式细胞术和Western blotting方法检测转染36 h后的各组U251细胞PTTG与survivin基因 mRNA和蛋白表达。结果：3个干扰组的U251细胞中PTTG和survivin基因mRNA和蛋白表达水平均较HK阴性对照组显著降低（P<0.01）,以共干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA组降低最明显。结论：共干扰pGenesil1-PTTG-survivin siRNA质粒对U251细胞中PTTG与survivin基因的沉默效应强于单独沉默其中某一基因的干扰质粒。     

PSMA7在胃癌中的表达及对胃癌增殖、侵袭迁移及成瘤能力的影响

目的研究PSMA7在胃癌中的表达及其对胃癌增殖、侵袭迁移及裸鼠皮下成瘤能力的影响。方法收集60例胃癌患者的 癌组织及配对的癌旁组织,应用免疫组化法检测胃癌和配对癌旁组织中PSMA7的表达水平;应用慢病毒转染技术在胃癌细胞 株SGC7901中干扰PSMA7;应用Cell Counting Kit-8（CCK-8）和细胞克隆形成实验检测胃癌细胞增殖能力的变化,Transwell实 验检测胃癌细胞侵袭迁移能力的变化;稳转细胞株构建裸鼠皮下移植瘤模型,研究干扰PSMA7对皮下移植瘤的影响。结果 免疫组化结果显示PSMA7在胃癌组织中的表达水平显著高于其配对的癌旁组织（P<0.05）;在人胃癌细胞株SGC7901中下调 PSMA7表达能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移能力（P<0.05）;在BALB/c小鼠皮下移植瘤模型中干扰PSMA7的表达能 够明显抑制皮下移植瘤的生长（P<0.05）。结论PSMA7在胃癌组织中高表达,干扰PSMA7抑制胃癌细胞增殖、侵袭迁移及裸 鼠皮下成瘤的能力。     

减毒沙门菌携带survivin特异性siRNA对肝细胞癌的生长抑制作用及其相关机制

目的：探讨survivin特异性siRNA对肝细胞癌HepG2细胞的生长抑制作用及减毒沙门菌携带survivin siRNA对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长抑制作用及其相关机制。方法：针对survivin的siRNA表达载体,脂质体和空质粒2个对照组分别转染肝细胞癌HepG2细胞后,应用RT-PCR和Western blott...     

沉默低氧诱导因子-2α下调DLK1表达对乳腺癌干细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的 探讨RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默低氧诱导因子-2α（hypoxia induciblefactor-2α,HIF-2αα）基因下调DLK1表达对乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells,BCSCs）裸鼠移植瘤生长的影响.方法 建立BCSCs裸鼠移植瘤模型,原位注射RNAi慢病毒载体和空载体慢病毒载体至裸鼠左右侧背部移植瘤组织中,定期观察成瘤时间、瘤体体积及重量,进一步绘制生长曲线及计算抑瘤率.HE染色检测移植瘤组织病理,RT-PCR和Western blot法检测移植瘤组织HIF-2α、DLK1及CD44 mRNA和蛋白表达.结果 成功建立BCSCs裸鼠移植瘤模型.与空载体组相比,RNAi组移植瘤生长速率、瘤体体积和重量均明显降低（15.1％ vs 21.6％,5.80 cm3 vs 3.30 cm3,3.0 g vs 1.7 g,P＜0.05）,抑瘤率为43.1％;HE染色显示RNAi组出现明显缺血坏死;RT-PCR结果提示RNAi组移植瘤组织中HIF-2α、DLK1及CD44蛋白表达均明显下调（0.59 ±0.02 vs 0.21 ±0.01,0.32 ±0.01 vs 0.08 ±0.01,0.76 ±0.03 vs0.04 ±0.01,P＜0.05）;Western blot结果也提示RNAi组移植瘤组织中HIF-2α、DLK1及CD44蛋白表达均明显下调（0.49 ±0.02 vs 0.28 ±0.01,0.43 ±0.02 vs0.11 ±0.01,0.62±0.03 vs 0.23±0.01,P＜0.05）.结论 沉默HIF-2α基因下调DLK1表达有效抑制BCSCs裸鼠移植瘤生长,DLK1可能参与BCSCs未分化表型维持,并增强其致瘤性.     

Effect of siRNA Targeting Survivin Gene on the Biological Behavior of Hepatocellular Carcinoma

To study the influence of siRNA targeting survivin gene on the biological behavior of hepatocellular carcinoma (HCC), one pair of 21bp reverse repeated motifs of survivin target sequence with 9 spacers were synthesized and inserted into plasmid psilencer2.1 to generate siRNA eukaryotic expression vector. After stable transfection into HepG2 cells, the biological behaviors of the survivin siRNA transfected HCC cells were observed. After the recombinant plasmid Psilence( )-survivin was successfully constructed, survivin mRNA and protein expression inhibition ratio reached 73% and 75% respectively compared to control groups. Transfected cells with survivin siRNA demonstrated significantly inhibited cell growth and increased apoptosis. Subsequent study in nude mouse model demonstrated lower succeeding rate in cells transfected with survivin siRNA and slow growth rate. The results elucidated the siRNA targeting survivin gene could specially suppress its expression in HepG2 cells and inhibit tumor cells growth both in vivo and in vitro. This provides a theoretical basis to turn the drug resistance in tumor cells.     

RNA干扰沉默survivin基因在抑制卵巢癌裸鼠移植瘤中的作用

目的 观察pshRNA-survivin在体内是否能抑制卵巢癌移植瘤体的生长.方法 建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,瘤内注射pshRNA-survivin,观察肿瘤生长情况.半定量RT-PCR、免疫组织化学检测移植瘤的survivin表达情况,TUNEL检测移植瘤的细胞凋亡情况.结果 pshRNA-survivin能明显抑制肿瘤组织中survivin的表达,促进肿瘤细胞的凋亡,减缓肿瘤生长速度.结论 pshRNA-survivin明显抑制了卵巢癌裸鼠移植瘤的增殖.     

双荧光标记的胶质瘤原位移植瘤模型的建立

目的建立一种稳定、可实时监测的胶质瘤原位移植瘤裸鼠模型。方法用带有荧光素酶(luciferase-Luc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein-GFP)基因的慢病毒感染U251神经胶质瘤细胞,流式细胞仪筛选稳定表达GFP-Luc荧光的细胞系,并通过CCK-8实验、细胞周期实验、Transwell肿瘤迁移及侵袭实验等评价荧光细胞的增殖、迁移和侵袭能力是否改变;将细胞接种至裸鼠大脑尾状核,建立胶质瘤原位移植瘤模型,利用小鼠活体成像系统监测脑内肿瘤的生长情况,并通过石蜡切片,HE染色评价细胞在裸鼠脑内的病理特征及成瘤能力。结果成功构建稳定表达GFP荧光和luciferase荧光的U251胶质瘤细胞系及动物模型,慢病毒整合并未改变细胞的增殖、迁移及侵袭能力;模型生长周期适中,成瘤率高,瘤体在颅内生长稳定,HE切片符合人胶质瘤特征。结论双荧光标记的胶质瘤细胞相比于传统细胞更有利于胶质瘤动物模型的实验研究;U251-GFP-Luc胶质瘤细胞裸鼠模型,其肿瘤生长和病理特性与人胶质瘤相似,且可实时观察肿瘤生长,可作为胶质瘤实验研究的理想动物模型。     

Inhibition of survivin expression and mechanisms of reversing drug-resistance of human lung adenocarcinoma cells by siRNA

Background Survivin, a member of the inhibitor of apoptosis protein （IAP） family, overexpresses in tumor cells and not expresses in terminally differentiated adult tissues. This study aimed to investigate the effects of survivin-specific siRNA on cell proliferation, apoptosis and chemosensitivity to cisplatin in vitro and in vivo and explore the mechanisms about decreasing expression of survivin in reversing cancer cells resistance to chemotherapeutic drug.Methods Survivin-specific siRNA was transfected into A549/DDP cells. The expression of survivin and lung resistance-related protein （LRP） mRNA levels were determined by RT-PCR, chemosensitivity of A549/DDP （cisplatin）cells to cisplatin was determined by MTT assay, and apoptosis and cell cycle were determined by flow cytometry （FCM）.The protein expression levels of survivin, LRP, cyclin-D1, caspase-3 and bcl-2 were determined by Western blotting analyses. The effect of survivin siRNA inhibition on tumor growth was studied in athymic nude mice in vivo.Results Survivin-specific siRNA efficiently down-regulated survivin expression. The cell cycle was arrested at G2/M phase, and apoptosis was obviously found. Inhibition of survivin expression could make the IC50 and drug-resistant index of cisplatin decrease, and enhance the cancer cells sensitivity to cisplatin. After transfection by survivin-specific siRNA, expression of LRP and cyclin-D1 were downregulated, caspase-3 expression was upregulated, bcl-2 expression had no obvious change. The animal experiment confirmed knockdown of survivin could inhibit the tumor growth.Conclusions Survivin-specific siRNA can efficiently suppress the expression of survivin, increase apoptosis, inhibit cells proliferation and enhance the chemosensitivity to cisplatin in vitro and in vivo. Suppression of survivin expression helping to reverse drug-resistance may have relationship with downregulation of LRP and upregulation of caspase-3.Anti-tumor strategies based on the inhibition of survivin may be useful in targeting lung adenocarcinomas.     

熊胆粉对肝癌移植瘤裸鼠血管生成和细胞周期的影响

目的探讨熊胆粉对肝癌移植瘤裸鼠血管生成和细胞周期的影响。方法用人肝癌HepG2细胞建立裸鼠移植瘤模型,待皮下移植瘤形成后,将裸鼠随机分为熊胆粉组和对照组,每天分别给予熊胆粉和生理盐水灌胃,日1次,连续21 d。3周后剥取肿瘤。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测p21、细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白(CyclinE)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR2)mRNA的表达;免疫组化检测p21、CDK2、CyclinE、VEGF、VEGFR2蛋白表达,并通过CD31表达检测微血管密度(MVD)。结果 MVD结果显示熊胆粉显著抑制体内微血管的形成,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);RT-PCR和免疫组化结果表明,熊胆粉显著促进p21的表达,抑制CDK2、CyclinE、VEGF、VEGFR2的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论熊胆粉诱导细胞周期阻滞和抑制血管生成可能是其治疗肝癌的作用机制之一。