低氧对A549细胞糖皮质激素受体表达的影响

目的研究不同低氧时间培养下,人肺腺癌上皮A549细胞糖皮质激素受体α(GRα)和糖皮质激素受体β(GRβ)的表达。方法将A549细胞分成6组,低氧组(3组)和对照组(3组),分别放置于低氧小室(37℃,95%N2,5%CO2)和普通培养箱中(37℃,95%空气,5%CO2)培养。24h、48h、72h后收集细胞,运用倒置显微镜下拍摄照片、RT-PCR和免疫细胞化学方法观察缺氧对A549细胞数目、形态以及细胞内GRα、GRβ mRNA和蛋白表达的影响。结果①低氧组细胞形态发生显著改变,随着低氧时间的延长,细胞生长速度逐渐减慢,细胞肿胀变形逐渐加剧。②RT-PCR的结果显示:24hGRα mRNA表达水平低氧组(0.914±0.079)与对照组(0.883±0.208)比较略有降低,但差异无显著性(P>0.05);48、72hGRα mRNA表达水平低氧组(0.794±0.029、0.828±0.171)与对照组(1.054±0.120、1.187±0.173)比较显著降低,差异有显著性(P<0.05);24、48、72hGRβ mRNA表达水平低氧组(0.439±0.175、0.437±0.117、0.433±0.101)与对照组(0.429±0.140、0.443±0.114、0.553±0.110)比较差异无显著性(P>0.05)。③免疫细胞化学的结果显示:24hGRα蛋白表达水平低氧组与对照组比较无显著改变;48、72hGRα蛋白表达水平低氧组与对照组比较显著降低;24、48、72hGRβ的蛋白表达水平低氧组与对照组比较无显著改变。结论低氧可导致A549细胞GRα的mRNA和蛋白表达水平显著降低;低氧环境可能会影响糖皮质激素作用的发挥。     

地塞米松上调HaCaT细胞糖皮质激素受体β的表达

目的探讨糖皮质激素对角质形成细胞的糖皮质激素受体β(glucocorticoid receptorβ,GRβ)表达的影响。方法采用反转录Real-time PCR和Western blotting,观察经不同浓度及不同时间的地塞米松作用下,培养的人角质形成细胞HaCaT细胞的GRβmRNA和蛋白质的表达情况。结果地塞米松可上调HaCaT细胞GRβ的表达,呈作用时间和剂量依赖性效应。结论糖皮质激素可诱导角质形成细胞GRβ表达增强,这可能部分解释持续外用糖皮质激素制剂的皮肤耐受现象以及对糖皮质激素局部治疗的抵抗。     

Calpain inhibitor Ⅰ对糖皮质激素受体表达和转录激活作用的影响

目的探讨Calpain inhibitor Ⅰ对糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)表达和转录激活作用的影响.方法 Raw-264.7细胞经地塞米松、Calpain inhibitor Ⅰ或两者共同处理12 h,观察糖皮质激素受体表达水平的变化.质粒PRsh-GRα和报告质粒pMAMneo-CAT 转入COS-7细胞,观察Calpain inhibitor Ⅰ对糖皮质激素受体转录激活作用的影响.结果 Raw-264.7细胞经地塞米松处理12 h后GR蛋白条带减弱,提示地塞米松可诱导GR表达下调,而 Calpain inhibitor Ⅰ可以部分抑制此作用.共转染实验表明Calpain inhibitor Ⅰ可增强地塞米松对GR的转录激活作用.结论 Calpain inhibitor Ⅰ可抑制糖皮质激素受体(激素依赖性受体)下调,并可增强GR的转录激活作用.     

特发性血小板减少性紫癜患者激素敏感性与糖皮质激素受体亚型的关系研究

目的探究特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者对糖皮质激素敏感性与其外周血单个核细胞内激素受体亚型表达的关系。方法采用实时定量RT—PCR和免疫组化技术检测不同激素敏感性ITP患者（包括糖皮质激素抵抗和敏感病人）外周血单个核细胞内α和β亚型糖皮质激素受体（GRα和GRβ）mRNA和蛋白表达，并将检测结果与正常对照组进行比较。结果糖皮质激素抵抗组患者外周血单个核细胞GRβmRNA表达量和GRβ蛋白表达阳性的单个核细胞比率明显高于激素敏感组及正常对照组（P〈0．01），而GRα mRNA和蛋白表达水平，各组之间无显著差异。结论ITP患者糖皮质激素敏感性与其GRβ表达水平密切相关。     

糖皮质激素对其受体、热休克蛋白90和组蛋白去乙酰化酶6的影响及中药干预研究

目的 检测应用肾上腺糖皮质激素后激素受体(GR)、热休克蛋白90(HSP90)和组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的变化及应用中药后对其干预情况.方法 采用实时定量PCR方法检测正常对照组、地塞米松组及地塞米松加中药组的GR、HSP90和HDAC6的mRNA表达情况.结果 与正常对照组相比,地塞米松组和地塞米松加中药组GR的表达水平均明显降低,差异有统计学意义.地塞米松组HSP90β mRNA表达水平与正常对照组相比明显降低,地塞米松加中药组HSP90β mRNA表达水平比地塞米松组升高,而比正常对照组低.地塞米松加中药组HDAC6 mRNA明显高于正常对照组和地塞米松组,差异有统计学意义.结论 应用糖皮质激素后GR减少;应用糖皮质激素后HSP90β减少,右归丸对其略有改善;应用糖皮质激素后再应用右归丸HDAC6升高.     

糖皮质激素对淋巴细胞受体表达的影响

目的 观察糖皮质激素(GH)对淋巴细胞受体(GR)及亚型表达的影响.方法 将10-5 mol/L 地塞米松(Dx)在淋巴细胞株Raji和Jurkat上作用3 d,采用Western blot方法检测GR在蛋白质水平上的变化,采用Real time方法检测GR及其亚型在mRNA水平上的变化.结果 应用Dx 24 h,总蛋白中GR表达明显减少,但在核蛋白中GR表达明显增多;在mRNA水平上hGRα亚型在用药前后无显著变化(P＞0.05),hGRβ亚型量极微,几乎不能检测.结论 GH影响GR的表达,GR活化后由细胞浆转入细胞核;hGRβ亚型的作用有待进一步研究.     

GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响

目的:构建糖皮质激素受体β(GRβ)不同表达水平的肾小球系膜细胞株,研究GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响.方法:利用逆转录病毒载体pLXSN将重组GRβ正义和反义基因转入肾小球系膜细胞,经细胞培养、逆转录聚合酶链反应、基因测序和蛋白质印迹分析鉴定所构建的细胞株,应用MTT法和流式细胞术检测细胞内不同表达水平的GRβ对地塞米松的细胞增殖抑制效应和细胞周期变化的影响.结果:构建的肾小球系膜细胞分别有正确的GRβ正义和反义基因整合,转染了GRβ正义基因的肾小球系膜细胞内GRβ蛋白质表达水平明显高于转染了GRβ反义基因者(109.74±10.63 vs.19.08±1.01,P＜0.05);地塞米松对GRβ高表达的肾小球系膜细胞的增殖抑制效率显著低于GRβ低表达的肾小球系膜细胞(18.47%±2.12% vs.60.33%±5.29%,P＜0.05).在地塞米松的抑制下,转染了正义GRβ基因的细胞中,其S期细胞降低程度和G1期细胞升高的程度均明显低于未转染的细胞.结论:肾小球系膜细胞内高表达的GRβ具有拮抗糖皮质激素效应的作用,细胞内GRβ表达水平是决定细胞对激素敏感或抵抗的重要因素.     

脂多糖作用大鼠肺泡巨噬细胞糖皮质激素受体表达及活性变化

目的探讨脂多糖作用大鼠肺泡巨噬细胞24 h内,糖皮质激素受体表达及活性变化特点.方法将原代培养的大鼠肺泡巨噬细胞分为脂多糖致伤组和地塞米松治疗组,采用RT-PCR和Western Blot在mRNA水平和蛋白质水平测定肺泡巨噬细胞糖皮质激素受体;EMSA测定肺泡巨噬细胞核蛋白中糖皮质激素受体活性.结果脂多糖作用后,糖皮质激素受体mRNA表达下调,24 h恢复正常水平;糖皮质激素受体蛋白质表达降低,4 h降至最低,24 h维持在低水平表达;糖皮质激素受体活性在1 h降到最低,24 h未恢复至正常水平.地塞米松治疗组在治疗后期不能有效维持糖皮质激素受体活性.结论脂多糖(100 ng/ml)作用大鼠肺泡巨噬细胞后,糖皮质激素受体蛋白表达降低,可能与mRNA表达降低及蛋白降解加速有关;糖皮质激素受体活性被显著抑制,出现糖皮质激素抵抗.     

TNF-α对人糖皮质激素受体表达的影响

目的: 研究TNF-α对人糖皮质激素受体(GR)表达的影响,探讨炎性细胞因子与糖皮质激素抵抗的相关性. 方法: 分离人外周血单个核细胞(PBMCs),用TNF-α刺激培养后,采用RT-PCR方法分析其与未用TNF-α刺激培养的PBMCs在GRα和GRβ mRNA表达方面的变化. 结果: 经TNF-α刺激培养24 h的PBMCs,与未加TNF-α刺激培养的PBMCs相比,GRα mRNA表达无显著变化(P>0.05),GRα/GAPDH mRNA分别为1.16 ±0.73,1.20±0.51,但GRβ mRNA表达明显增加(P<0.05),GRβ/GAPDH mRNA分别为1.62±0.59,0.81±0.66. 结论: TNF-α可以增加GRβ的表达,这可能是炎性细胞因子诱发糖皮质激素抵抗的内在机制之一.     

激素性高眼压患者外周血单个核细胞糖皮质激素受体α、β的表达及意义

目的 检测糖皮质激素性高眼压患者外周血单个核细胞(PBMCs)内糖皮质激素受体(GR)亚型GRα和GRβ mRNA的表达,并探讨其与激素性青光眼的关系.方法 收集9例激素性高眼压患者(高眼压组),10例用激素后眼压正常患者(正常眼压组),10例健康志愿者(对照组)的外周血,提取单个核细胞RNA,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PBMCs内GRα、GRβ mRNA表达水平.结果 外周血单个核细胞有GRα、GRβ mRNA表达,以GRα为主.高眼压组的GRα mRNA半定量比值为(1.11±0.17),与对照组(1.07±0.09)和正常眼压组(1.06±0.11)相比,其表达增高,差异有显著性意义(均P<0.05).高眼压组、正常眼压组、对照组的GRβ mRNA半定量比值分别为(1.030±0.004)、(1.040±0.004)、(1.030±0.006),3组之间的表达差异无显著性意义(均P0.05).结论 外周血GRαmRNA的表达水平与糖皮质激素性青光眼的发病密切相关,外周血GRβ mRNA与激素性青光眼的关系可能不大,但GRβ的作用仍需从其他方面继续研究.     

Livinα和Livinβ在儿童急性白血病骨髓单个核细胞中的表达及临床意义

目的 研究Livinα和Livinβ在儿童急性白血病(childhood acute leukemia,CAL)骨髓单个核细胞(marrow mononuclear cell,MMNC)中的表达与临床意义.方法 采用实时PCR(real-time PCR)和Western blot检测Livinα和Livinβ在CAL骨髓单个核细胞中mRNA水平和蛋白质水平的表达.结果 Livinα和Livinβ在初诊的39例儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和12例急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)MMNC中的表达率和表达水平均高于对照组(P<0.05),Livinα的表达水平高于Livinβ(P<0.01).ALL化疗后第19天,幼稚细胞≤5%组Livinα和Livinβ的表达水平较化疗前明显降低(P<0.01).幼稚细胞5%组化疗后较化疗前也降低(P<0.05),但化疗后Livinα和Livinβ的表达水平仍明显高于对照组(P<0.01).结论 Livinα和Livinβ在CAL中高表达可能对评估CAL临床危险度及预后有重要意义;提示Livinα和Livinβ可作为观察CAL预后的分子指标之一.     

右美托咪定对老年肝癌病人术后炎症及认知功能的影响

目的 观察右美托咪定（Dex）对老年肝癌病人术后炎症细胞因子和早期认知功能的影响。 方法 选取择期进行肝癌切除术的老年肝硬化病人52例,Child-Pugh肝功能分级为A级,ASA Ⅱ~Ⅲ级,随机分为对照组（Con组）和右美托咪定组（Dex组）,各26例。Con组采用常规全身麻醉,Dex组在常规全身麻醉基础上于麻醉诱导前泵注Dex（0.5 μg/kg）10 min,并以0.4 μg·kg-1·h-1持续泵注至关腹。检测2组病人术前1 d与术后即刻、术后24 h、术后48 h血S-100β蛋白、炎症细胞因子等指标,并采用简易精神状态评价量表（MMSE）评估病人认知功能。 结果 2组外周血S-100β蛋白、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α水平在术后不同时间点均较术前不同程度的升高（P < 0.05~P < 0.01）;Dex组S-100β蛋白、IL-6、TNF-α水平在术后即刻、术后24 h和术后48 h均明显低于对照组（P < 0.05~P < 0.01）。Dex组术后认知功能障碍发生率明显低于Con组（P < 0.05）。 结论 Dex能降低老年肝癌病人术后认知功能障碍的发生率,其机制可能与减轻炎症反应有关。     

淫羊藿苷对多发性硬化患者PBMC ER、GR mRNA表达的影响

目的 探讨淫羊藿苷(ICA)对多发性硬化(MS)患者外周血单个核细胞(PBMC)中ERα、ERβ、GR mRNA表达水平的影响及其剂效关系.方法 分离、提取MS患者及健康人PBMC并将其均分为空白对照组、雌激素组、高、中、低剂量ICA组以及对应浓度的空白血清对照组各8个亚组,培养后离心,以RQ-PCR法检测各组PBMC中ERα、ERβ、GR mRNA的表达量.结果 MS患者高、中剂量ICA及雌激素组ERα表达量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);MS患者高剂量ICA及雌激素组ERβ mRNA表达量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05).MS患者和健康人中实验组与各对照组比较GR mRNA表达量无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05).MS患者与健康人高剂量ICA组比较,ERα、ERβ mRNA表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 ICA可以提高MS患者PBMC中ERα、ERβ mRNA的表达,具有拟雌激素样作用,但对MS患者PBMC中GR mRNA的表达无明显干预作用.     

大鼠肺泡巨噬细胞Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1表达变化及其调节糖皮质激素受体功能的研究

目的：在模拟大鼠肺泡巨噬细胞炎症合并糖皮质激素治疗的条件下，阐明Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1（BAG-1）的表达变化及其对糖皮质激素受体（GR）功能的调节作用。方法：Western blot检测脂多糖（LPS）和地塞米松（Dex）作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1表达变化；免疫共沉淀法检测核蛋白中BAG-1与GR相互结合作用；相对荧光素酶法检测GR转录激活活性。结果：LPS和Dex作用后，细胞总蛋白中BAG-1L表达增加，BAG-1S表达无变化；核蛋白中只能检测到BAG-1L，表达量在LPS作用24h内逐渐增加；细胞核内BAG-1L与GR在LPS和Dex作用后存在着相互结合，同时GR转录激活活性逐渐降低，其变化与核蛋白中BAG-1L表达变化呈负相关。结论：LPS和Dex作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1L表达增加，与GR结合后共同转核，并抑制GR活性。该机制可能是感染条件下糖皮质激素抵抗的重要因素。     

糖皮质激素对糖皮质激素受体的调节 Ⅰ.人体肝癌细胞系(SMMC-7721)的研究

建立了糖皮质激素受体(GR)的计数瓶培养测定法。用此法研究了10~(-8)、10~(-7)和10~(-6)mol/L地塞米松对人体肝癌细胞系(SMMC-7721)GR的影响,发现地塞米松使GR减少。去除地塞米松后24h,GR恢复到接近原来的水平。结果证明,糖皮质激素对GR呈现负调节。     

脑梗塞后炎性因子与细胞凋亡动态变化的研究

目的：观察局灶性脑缺血大鼠炎性因子与细胞凋亡相关指标的改变,探讨炎性反应与细胞凋亡在脑梗塞后的变化及其内在机制。方法：采用插线法致大脑中动脉栓塞（M CAO）2 h制备局灶性脑缺血大鼠模型,分别于再灌注6、12、24、48、72和168 h取血并处死动物取相应标本。检测腹动脉血液流变学动态变化;采用酶联免疫吸附法（EL ISA）和放射免疫竞争法测定脑组织白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量;用苏木素-伊红（HE）染色法观察脑细胞的病理形态学变化并进行细胞计数;用原位末端缺刻标记法检测细胞凋亡情况。结果：与假手术组比较,模型组缺血侧脑组织炎症细胞因子IL-1β水平于再灌注6～24 h明显增高,TNF-α含量于再灌注24～48 h显著增多（P〈0.05）;再灌注6～72 h脑缺血梗死区细胞数量明显减少,12～72 h凋亡细胞大量出现（P〈0.01）。结论：炎症因子IL-1β与TNF-α的生成与释放在6～48 h时增多;细胞凋亡作为缺血损伤后神经元损失的主要形式之一,在24～48 h时最为严重;缺血脑区的形态学变化在缺血后24 h最为严重。     

NALP3炎性复合体及p38 MAPK信号通路在氧化应激中的作用及阿魏酸钠的干预机制

目的探讨氧化应激时成纤维细胞（NIH-3T3）中NALP3炎性复合体、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的变化及阿魏酸钠的干预机制。方法将NIH-3T3细胞分为6组:对照组;H2O2 （200 μmol/L）刺激组;阿魏酸钠（400 μg/mL）组;H2O2 +N-乙酰半胱氨酸（H2O2 200 μmol/L+ NAC 5 mmol/L）组（抗氧化组）;H2O2 + p38 MAPK抑制剂（H2O2 200 μmol/L+ SB203580 5 μmol/L）组（p38 MAPK阻断剂组）;阿魏酸钠干预(H2O2 200 μmol/L+阿魏酸钠 400 μg/mL)组。培养24 h后,荧光定量PCR检测各组NIH-3T3细胞中NALP3、Caspase-1及P38α mRNA的表达;培养48 h后,Western blot检测各组NIH-3T3细胞中NALP3、p-p38和p38蛋白的表达量（p-p38为p38活化表示形式,p38 MAPK信号通路的活化用p-p38/p38表示);培养24 h后,ELISA检测各组细胞的上清液中白细胞介素（IL）-1β的含量。结果相比于对照组,H2O2 的刺激可以上调NIH-3T3细胞中NALP3、Caspase-1及P38α mRNA的表达,NALP3及p-p38/p38蛋白的表达量,以及IL-1β分泌均增加（P均＜0.05）;抗氧化组、p38 MAPK阻断剂组及阿魏酸钠干预组相较于H2O2 刺激组,NALP3、Caspase-1及P38α mRNA的表达量以及NALP3、p-p38/p38蛋白的表达量均降低,IL-1β的释放也减少（P均＜0.05）;而抗氧化组、p38 MAPK阻断剂组及阿魏酸钠干预组间上述指标的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论阿魏酸钠可能通过抑制p38 MAPK通路的活化降低NALP3炎性复合体、Caspase-1和IL-1β的表达,从而下调炎症级联反应。     

Rapamycin Sensitizes Glucocorticoid Resistant Acute Lymphoblastic Leukemia CEM-C1 Cells to Dexamethasone Induced Apoptosis through both mTOR Suppression and Up-Regulation and Activation of Glucocorticoid Receptor*

Objective To explore the role of glucocorticoid (GC) receptor (GR) in rapamycin’s reversion of GC resistance in humanGC-resistant T-acute lymphoblastic leukemia (ALL) CEM-C1 cells. Methods CEM-C1 cells were cultured in vitro and treated with rapamycin at different concentrations with or without 1 μmol/L dexamethasone (Dex). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) test was performed to assess cell proliferation. The cell cycle and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. The expression of GRα mRNA was determined by real-time quantitative RT-PCR. The expression of GR, p-70S6K, Mcl-1, and Bim proteins was detected by Western blot. Results When incubated with rapamycin at different concentrations, CEM-C1 cells showed significant growth inhibition in a time- and concentration-dependent manner. The growth inhibition was synergistically increased when CEM-C1 cells were treated with rapamycin plus 1 μmol/L Dex. CEM-C1 cells treated with rapamycin alone showed no apparent apoptosis, and were arrested at G0/G1 phase. After the treatment with Dex plus rapamycin, CEM-C1 cells demonstrated apparent apoptosis and increased the cell cycle arrested at G0/G1 phase. Rapamycin combined with Dex up-regulated GRα, phosphorylated GR(p-GR), and pro-apoptotic protein Bim-EL in CEM-C1 cells, but inhibited the expression of p-p70S6K, a downstream target protein ofmTOR (mammalian target of rapamycin). Conclusion After the treatment with rapamycin plus Dex, Dex resistant CEM-C1 cells induce growth inhibition and apoptosis. The underlying mechanism may involve inhibition of the mTOR signaling pathway and also be associated with up-regulation of GR expression and activation of GC-GR signaling pathway.     

地塞米松对顺铂诱导人肺腺癌细胞株凋亡的抑制作用及其机制

目的 研究地塞米松（Dex）对顺铂（CDDP）引起的人肺腺癌细胞株SPCA/Ⅰ凋亡的抑制作用及其分子机制探讨。方法 体外培养SPCA/Ⅰ细胞,分别加入不同浓度Dex培养24 h后,加入不同浓度CDDP继续培养48 h,采用二甲基溴化四氮唑蓝（MTT）法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡;用1 μmol/L Dex刺激SPCA/I细胞,分别于1 h、2 h、4 h、6 h、12 h采用RT-PCR技术,检测SPCA/I细胞中糖皮质激素诱导的蛋白激酶1基因（SGK-1）和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（MKP-1）基因的表达;用生物素标记的抗糖皮质激素受体（GR）抗体对SPCA/I细胞中GR行细胞免疫组化检测。结果 SPCA/I细胞经Dex刺激后,对CDDP所致的抑制细胞生长和凋亡呈抵抗作用（P<0.05）。 Dex刺激后的SPCA/I细胞表达SGK-1上调,在12 h时表达达高峰,未检测到MKP-1表达;细胞免疫组化显示SPCA/Ⅰ细胞经Dex刺激后GR表达上调,细胞内GR数目高于对照组（P<0.05）。结论 体外实验结果表明,Dex对CDDP引起的SPCA/I细胞凋亡有抑制作用。其分子机理可能是通过上调细胞内GR数目,增强通路下游SGK1的表达,从而产生抗凋亡作用。