Pumilio家族基因诱导性敲除小鼠模型的构建

目的：为探究出生后Pumilio家族的功能及其缺失对个体的影响,构建Pumilio1（Pum1）和Pumilio2（Pum2）双基因诱导性敲除的小鼠模型。方法：通过小鼠交配实验得到R26-ER^T2 Cre/+Pum1^flox/flox Pum^2-/-小鼠,并将同窝雄鼠设为对照组和实验组。分别对实验组3周和成年小鼠注射他莫昔芬,在DNA、RNA和蛋白水平表征主要脏器中Pum1的敲除效果;并表征精子发生过程中的病理变化、细胞增殖及凋亡情况。结果：实验组3周和成年雄鼠的胸腺和睾丸组织中Pum1表达水平极低,敲除效率均高于50%,Pum1和Pum2双基因诱导性敲除小鼠模型构建成功。在注射他莫昔芬结束的第21天,3周雄鼠胸腺、脾脏和睾丸的重量明显下降,睾丸病理HE染色实验显示精子形成障碍,TUNEL和BrdU染色后计数结果显示睾丸中生精细胞凋亡增加、增殖减慢。成年小鼠在注射他莫昔芬恢复后,Pum1在胸腺、心、肝、睾丸中的表达仍有降低,但睾丸病理HE染色显示精子发生未见异常。结论：该模型的建立首次展示Pumilio家族蛋白作为未来药物靶标的潜能,为深入研究Pumilio的功能及作为肿瘤治疗靶蛋白的研究奠定了理论基础。     

Pum基因在小鼠海马的转录

目的：依据Pum蛋白序列寻找和人类亲缘关系较近的动物模型，并在动物模型的脑组织上进行Pum mRNA的定性和定位。方法：查找相关动物的Pum蛋白序列，构建生物进化树，寻找合适的动物模型。RT—PCR扩增Pum片断，接入TA载体制作亚克隆，转化细菌后筛选、扩增、抽提，然后测序鉴定。体外转录Pum基因的mRNA探针，将其和脑组织冰冻切片原位杂交、显色。结果：生物进化树提示，小鼠是合适的动物模型；原位杂交结果显示，小鼠海马区存在Pum1和Pum2 mRNA的表达。结论：小鼠是研究Pum基因在海马转录的合适动物模型。     

利用CRISPR/Cas9系统快速建立APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型

目的利用CRISPR/Cas9系统构建APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病（AD）小鼠模型,为开展AD的病因治疗提供载体。方法采用CRISPR/Cas9系统,选择H11作为插入位点,将有活性的sgRNA、Cas9RNA和含有目标同源重组序列的载体显微注射入C57BL/6品系野生雌性小鼠的受精卵中,鉴定得到的F0代阳性小鼠再与C57BL/6野生小鼠交配,从而获得F1代小鼠。对鉴定得到的F1代杂合子小鼠,选择来自同一只F0代小鼠基因型一致的F1代杂合子小鼠,达到性成熟后进行同胞交配,获得F2代小鼠。采用PCR方法鉴定F2代小鼠的基因型结果,采用Westernblot检测APP和PS1在F2代小鼠脑组织中的蛋白表达水平。结果27只F2代小鼠经PCR鉴定基因型,5只F2代小鼠出现约344bp和608bp的目的基因条带,表明成功构建出转入APP和PS1基因的APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。Westernblot检测显示APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠的APP和PS1的表达水平均明显高于同窝野生型小鼠。结论利用CRISPR/Cas9系统可成功构建APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠。     

ApoE^-/-；SAP—Tg小鼠模型的构建

目的为研究SAP蛋白在动脉粥样硬化中的作用及机制,拟构建ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠模型。方法分别选取6～8周龄的雄性ApoE^-/-小鼠与血清淀粉样蛋白P转基因（SAP—Tg）6周龄的雌性小鼠杂交,得到的杂交后代以剪尾方式提取基因组DNA,用PCR法检测小鼠的基因型。结果雄性ApoE^-/-小鼠与雌性SAP-Tg小鼠杂交得F1代后自交,在F2代获得ApoE^-/-;SAP—Tg基因型小鼠,模型构建成功。结论将ApoE^-/-小鼠与SAP—Tg小鼠杂交2代后成功建立了ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠模型,并可通过筛选出的F2代ApoE^-/-小鼠和ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠交配进行繁育筛选工作。     

乙基亚硝基脲构建β-地贫小鼠模型的初步研究

目的以MCHC、MCH和Hb A、Hb A2、Hb F等血象为观察指标,探讨乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)复制β-地贫模型的可行性。方法实验设模型组和正常对照组两组。模型组:先给雄性DBA/2J小鼠腹腔注射乙基亚硝基脲(200 mg/kg体重),经9周诱发遗传基因突变,然后将其与正常雌性C57BL/6J小鼠杂交繁育出具有β-地中海贫血特征的模型杂交F1代小鼠。正常对照组:将正常雄性DBA/2J小鼠与正常雌性C57BL/6J小鼠杂交繁育出正常杂交F1代小鼠。结果与正常杂交F1代小鼠比较,模型杂交F1代的部分小鼠血MCHC、MCH、Hb A显著降低,Hb A2和Hb F显著升高(P0.05或P0.01)与临床初步诊断患者为β-地中海贫血的相应血象指标的变化趋势相一致。结论乙基亚硝基脲可诱发小鼠类似β-地中海贫血。     

Chk2敲除可通过增强抗氧化能力改善由Bmi⁃1缺失所致的小鼠脑衰老表型

目的：探索细胞周期检测点激酶2（cell?cycle checkpoint kinase 2,Chk2）敲除是否能改善由B淋巴瘤Mo?MLV插入区1（B cell?specific MLV integration site?1,Bmi?1）缺失所致的小鼠脑衰老表型。方法：取2月龄Bmi?1基因敲除（Bmi?1-/-）小鼠、Chk2基因敲除（Chk2-/-）小鼠、Bmi?1和Chk2双敲（Bmi?1-/-Chk2-/-）小鼠以及同窝野生型（wild type,WT）小鼠脑组织,通过免疫组织化学染色检测不同组小鼠脑组织皮层、海马、下丘脑中NeuN、GFAP、Iba1、p16等指标的变化,通过Western blot检测不同组小鼠脑皮质中p16、SOD1、SOD2蛋白表达量的差异。结果：与同窝WT小鼠相比,Bmi?1?/?小鼠在上述脑区中NeuN、Iba1阳性细胞百分率明显减少,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显增加,SOD1、SOD2蛋白表达量明显降低,p16蛋白表达量明显上升,而在Chk2-/-小鼠中NeuN、Iba1阳性细胞百分率则增加,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显减少,SOD1、SOD2蛋白表达量明显上调,p16蛋白表达量明显下降;与Bmi?1-/-小鼠相比,Bmi?1-/-Chk2-/-小鼠在上述脑区中NeuN、Iba1阳性细胞百分率明显增加,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显减少,SOD1和SOD2蛋白表达量明显上升,p16蛋白表达量明显下降。结论：Chk2敲除可通过增强抗氧化能力,从而改善由Bmi?1缺失所致的小鼠脑衰老表型。     

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除AR和IRS2基因大鼠

目的探讨应用CRISPR/Cas9技术制备敲除雄激素受体(AR)和胰岛素受体底物2(IRS2)基因大鼠,构建可用于研究的稳定遗传的基因敲除大鼠品系。方法针对与雄激素表达相关基因-AR基因和胰岛素表达有关的胰岛素受体底物(IRS)基因设计出了20 bp的AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,F0代大鼠出生后取其基因组DNA测序鉴定基因型后,对确认敲除的大鼠F0与野生型交配,获得杂合子F1代。结果设计了20 bp AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,与Cas9一起进行了体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,共获得2个受精卵并移植到1只雌性代孕大鼠。繁殖出嵌合体大鼠F0 2只(#51,#56),F0#51、#56与野生型大鼠合笼,繁殖出F1大鼠9只,其中F0#51繁殖出3只为双敲大鼠(#12,#13,#18),其余6只为单敲大鼠,F0#51产生的3只双敲大鼠发生不同程度的碱基插入或缺失,其中#12,#18大鼠在AR基因上缺失7个碱基(CCCCGGC),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。#13大鼠在AR基因上插入2个碱基(CG),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。大鼠的AR、IRS2基因表达被破坏。结论采用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除基因AR、IRS2大鼠,经基因测序和蛋白质免疫印迹鉴定AR、IRS2,证明正确,为下一步鉴定是否表现出多囊卵巢综合征表型特征打下基础。     

应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

小鼠雌性和雄性胚胎原始生殖细胞发育的比较研究

目的 观察研究小鼠雄性和雌性胚胎中原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs)发育的差异,为进一步深入研究PGCs以及生殖细胞发育的基因调控提供实验依据.方法 在本研究采用C57BL/6J小鼠胚胎为实验材料,通过石蜡切片、免疫荧光组织化学染色方法,检测C57BL/6J小鼠胚胎在11至13.5d之间生殖嵴发育的形态学改变,比较雌性和雄性胚胎中原始生殖细胞数量与增殖的变化.结果 发现雄性和雌性胚胎中PGCs的数量在13.5d最多,而处于增殖期的PGCs在13d时最多;在13d的雄性胚胎中,PGCs数量上显著高于雌性,并且其中增殖期的PGCs也较雌性的多.结论 在胚胎发育早期(11至13.5d),小鼠PGCs的发育存在性别差异.     

TNFα和TNFR1基因敲除小鼠对内质网应激反应所致急性肾损伤的易感性及其机制研究

1材料与方法1.1小鼠C57/B6小鼠,雌性,3-5月龄,TNFα-/-、TN-FR1-/-、TNFR2-/-和TNFR1R2-/-小鼠,购买于Jackson实验室(Bar Harbor,ME)。所有基因敲除小鼠与C57/B6小鼠回交至少6代。PCR基因分型参照Jackson实验室提供的方法(http://jaxmice.jax.org/prot     

Effect of estrogen deprivation on follicle/oocyte maturation and embryo development in mice

Estrogenissynthesizedbygranulosacellsunderthecontroloffolliclestimulatinghormone (FSH )andluteinizinghormone (LH) Itisbelievedthatestrogenplayspivotalrolesintheregulationoffollicle/oocytematurationandoocytefertilizability Estrogenisalsoinvolvedinthefunctionalpreparationofthefallopiantubesforsubsequentgameteinteraction ,inearlyembryonicdevelopmentoccurringinthetubalmicroenvironment,andinthepreparationoftheuterusforimplantation However,areevaluationoftherolesofLH ,FSH ,andestrogenhasbeensug…     

降钙素基因相关肽对卵母细胞体外成熟的影响

目的:探讨降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法:6 周龄雌性昆明小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)10 U 48 h 后处死, 取出卵巢收集卵母细胞以30~40 枚/ 孔的密度接种于培养板内, 以不同浓度CGRP(0, 10^-10, 10^-9, 10^-8 mol/L) 处理24 h后检测生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD) 率和第一极体(polarbody I, PBI) 排出率;收集、培养人卵巢颗粒细胞, 以不同浓度CGRP(0, 10^-10, 10^-9, 10^-8 mol/L) 处理24 h 后测定颗粒细胞内cAMP 浓度。结果:外源性CGRP处理小鼠卵母细胞可浓度依赖性地降低GVBD 率及PBI 排出率;外源性CGRP 处理人颗粒细胞, 可浓度依赖性地增高细胞内cAMP 浓度。结论:CGRP 抑制小鼠卵母细胞成熟可能与其增加颗粒细胞内cAMP 浓度有关。     

全基因组扫描2型糖尿病KKTa小鼠白蛋白尿易感基因定位

 目的 利用全基因组扫描方法进行2型糖尿病KKTa小鼠白蛋白尿易感基因定位。方法 以近交纯品系雌性BALBc小鼠与雄性KKTa小鼠交配建立第一代杂交小鼠(F1),以雄性(KKTa×BALBc)F1小鼠与雌性KKTa小鼠回交。提取208只雄性回交小鼠基因组DNA。根据扩增的101个微卫星DNA分离片段大小决定回交小鼠基因型,同时测定体质量、血糖、尿白蛋白及尿肌酐等表现型。采用基因定位专用软件(MAPMAKERQTL, Map manager)进行数量性状位点(QTL)分析。结果 KKTa小鼠的体重、空腹血糖水平、经腹腔葡萄糖耐量试验空腹与注射葡萄糖后2 h血糖之和显著高于BALBc和F1小鼠(P0.01)。20,28周龄的KKTa小鼠平均尿白蛋白水平显著高于BALBc和F1小鼠(P0.01)。20周龄与28周龄的白蛋白尿水平与第2条染色体83.0 cM D2Mit311微卫星DNA标记附近区域显著连锁,最大对数优势积分值(LOD)为3.5,我们将这一易感基因座位命名为UA-1(尿白蛋白1)。KKKK组回交小鼠20周龄和28周龄的尿白蛋白水平显著高于KKBALB组回交小鼠。结论 与2型糖尿病KKTa小鼠尿白蛋白水平紧密连锁的易感基因座位位于第2条染色体83.0 cM处D2Mit311微卫星DNA标记附近区域（UA-1）。UA-1区域附近的生长激素释放激素(GHrH)基因Ghrh、生长抑素受体4基因Smstr4、血栓调节蛋白(TM)基因Thbd等为糖尿病肾病的可能易感基因。     

LH/EGF诱导ICR小鼠窦状卵泡卵母细胞体外成熟与排卵的研究

目的：利用医学研究常用ICR品系小鼠,在建立窦状卵泡体外培养体系的基础上,研究黄体生成素（luteinizing hormone,LH）与表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）诱导卵母细胞体外成熟及排卵的作用。方法：体外剥离得到大的窦状卵泡用于培养并建立适宜于研究诱导卵母细胞成熟及排卵的窦状卵泡体外培养模型,通过向培养液中添加LH和EGF诱导卵母细胞体外成熟与排卵。结果：成功构建了ICR小鼠窦状卵泡体外培养模型,发现LH或EGF单独处理均可诱导卵泡卵母细胞成熟和卵丘扩展,而两者共同作用才能够诱导卵泡体外排卵。结论：LH/EGF促进ICR小鼠窦状卵泡卵母细胞体外成熟与排卵。     

Developmental Toxicity in Mice Following Paternal Exposure to Di-N-Butyl-Phthalate （DBP）

Objective The aim of the present study was to investigate the effects of paternal Di‐N‐butyl‐phthalate (DBP) exposure pre‐ and postnatally on F1 generation offspring,and prenatally on F2 generation offspring.Methods Male mice were exposed to either 500 mg/kg or 2 000 mg/kg of DBP for 8 weeks,and mated with non‐exposed females.Three‐quarters of the females were sacrificed a day prior to parturition,and examined for the number of living and dead implantations,and incidence of gross malformations.Pups from the...     

胎肝干细胞抗原阳性细胞向肾脏细胞分化的研究

目的　探讨小鼠胚胎肝组织中的 ,干细胞抗原 1阳性的细胞 (Sca 1+ 细胞 )向肾组织上皮细胞分化的潜能。方法　取 14 5d的小鼠胎肝 ,制作细胞悬液 ;用单克隆免疫磁珠细胞分离技术分离Sca 1+ 细胞 ;用PCR鉴别Y-染色体性别决定区域 (SRY)基因序列 ;将 2× 10 3 个雄性小鼠Sca 1+细胞输注给经 10Gy剂量60 钴全身照射的雌性小鼠体内 ;于移植后 2个月 ,处死受体小鼠 ,取肾脏组织固定 ,制片 ;用免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠肾脏组织内供体小鼠胎肝Sca 1+细胞的分布和横向分化情况。结果　在肾小管上皮内和肾小球边缘 ,分别发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞 ,同时呈现肾组织的部分特征 ,表型分别为RCA+ 、CYP+ 1A2 、CD4 5 -、F-4/ 80 和波形蛋白阳性、CD-45、F-4/ 80 。结论　小鼠胎肝Sca 1+ 细胞 (其中绝大部分是造血干细胞 ) ,具有向肾组织上皮细胞分化的潜能     

点突变Uchl1不影响小鼠卵母细胞成熟

目的 通过观察突变蛋白与野生蛋白过量对卵母细胞成熟过程的影响,分析Uchl1在小鼠卵母细胞离体成熟中发挥的作用及其作用方式。方法 通过原核重组蛋白技术制备点突变（C90S和I93M）和野生型Uchl1蛋白,通过蛋白微量注射技术将突变蛋白与对照蛋白注射到未成熟卵母细胞,或体外培养液中添加突变蛋白与野生型蛋白,分析野生型Uchl1过量,或突变Uchl1-I93M蛋白添加,或泛素水解酶活性缺失的Uchl1-C90S突变蛋白添加,对于卵母细胞体外成熟的影响。结果 显微注射UCHL1融合蛋白的各组之间以及与注射PBS之间, GVBD率差异没有达到统计学显著性;同时培养液中添加Uchl1的GST融合蛋白,相对于无注射对照组,也没有统计学显著差异（P>0.05）。注射GST-C90S融合蛋白组少量GV期卵母细胞体外发育为MII期卵母细胞后呈现极体偏大于对照组。I93M点突变小鼠与WT小鼠比较,GV期卵母细胞体外GVBD率无显著差异。结论 在小鼠卵母细胞中,添加外源性Uchl1,或者有毒性作用的I93M突变体,或者水解酶活性结构改变的C90S突变体,均不影响卵母细胞成熟的GVBD进程。即使构建的I93M点突变小鼠卵母细胞GVBD率无异常。但是,其水解酶活性位点突变影响极体的形成。     

Kindlin-2通过mTOR和Hippo信号通路调节小鼠子宫内膜发育

目的: 探讨Kindlin-2对小鼠子宫发育及雌鼠生育能力的影响及其作用机制。方法: 利用Cdh16-Cre工具鼠和Kindlin-2^flox/flox小鼠构建在子宫内膜中特异性敲除Kindlin-2的小鼠模型,观察敲除Kindlin-2对雌鼠子宫内膜发育和生殖力的影响。在子宫内膜癌细胞系HEC-1和Ish中分别进行高表达和敲低Kindlin-2的实验,检测雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的激活变化,并且提取特异性敲除Kindlin-2的雌鼠(实验组,基因型为Cdh16-Cre; Kindlin-2^flox/flox)和未特异性敲除Kindlin-2的雌鼠(对照组,基因型为Kindlin-2^flox/flox)子宫蛋白,每组包含6~8只小鼠,重复3次独立实验,检测mTOR信号通路和Hippo信号通路关键分子的蛋白水平。结果: 成功构建了子宫内膜特异性敲除Kindlin-2的小鼠模型,通过鼠尾聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、Western blot、免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)等方法鉴定和验证Kindlin-2在小鼠子宫中的敲除效率。子宫内膜特异性敲除Kindlin-2的雌鼠与对照组相比体质量减轻、生殖能力严重受损、出生仔鼠数量减少,但出生仔鼠中雌鼠和雄鼠的比例未发生改变,通过苏木精-伊红染色实验观察表明实验组子宫内膜发育不完整、子宫壁厚度变薄。机制方面,子宫内膜癌细胞系HEC-1和Ish中敲除Kindlin-2能够下调mTOR、磷酸化mTOR、腺嘌呤核糖核苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、磷酸化的AMPK和磷酸化的核糖体蛋白(ribosomal protein S6,S6)的蛋白水平,在雌鼠子宫中发现特异性敲除Kindlin-2能够上调Mps结合1(Mps one binding 1,MOB1)、磷酸化的Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)的蛋白水平。结论: Kindlin-2通过抑制mTOR信号通路、激活Hippo信号通路抑制子宫内膜的发育,进而抑制雌鼠的生育能力。     

1990—2010年中国女性早婚和生育的地区不平等性

目的 分析1990—2010年中国15~19岁女性青少年结婚和生育的地区不平等性。方法 利用1990—2010年三次全国人口普查汇总数据,计算中国15~19岁女性青少年的已婚率和生育率。将各省份人均国内生产总值(gross domestic product,GDP)作为社会经济发展水平指标,计算女性青少年已婚率和生育率的不平等绝对指数(slope index of inequality,SII)和集中指数(concentration index,CI),并建立线性回归模型衡量已婚率和生育率与人均GDP的关联。结果 1990—2000年,全国15~19岁女性的已婚率从4.7%下降至1.2%,但在2010年反弹至2.1%。生育率从1990年的22.0/1 000人下降至2000年的6.0/1 000人,2010年进一步下降为5.9/1 000人。1990年,15~19岁女性青少年已婚率和生育率地区层面的社会经济不平等性不具有统计学意义(SII和CI均P>0.05)。SII分析显示,2000和2010年,人均GDP最低人群的已婚率比最高人群分别高2.4%(95%CI:0.4~4.4)和2.3%(95%CI:0.3~4.2)。与此同时, 2000年和2010年人均GDP最低人群的生育率比最高人群分别高12.9/1 000人(95%CI:5.4~20.5)和9.3/1 000人(95%CI:4.6~14.0)。已婚的CI值在2000年和2010年分别为-0.32(P=0.02)和-0.17(P=0.03), 生育的CI值在2000年和2010年分别为-0.37(P<0.01)和-0.26(P<0.01)。2000年,人均GDP上升100%,已婚率平均下降1.4%(95%CI:0.1~2.7),生育率平均下降7.9/1 000人(95%CI:2.9~12.8)。2010年,人均GDP上升100%,已婚率平均下降1.5%(95%CI:0.1~2.9),生育率平均下降6.7/1 000人(95%CI:3.2~10.1)。结论 2000年和2010年存在女性青少年早婚早育地区层面的社会经济不平等性,生活在经济发展水平较低的女性青少年更容易早婚早育;减少收入不公平、增加对贫困地区的教育投资可能是改善早婚早育地区不平等的有效措施。