SPF鸡感染J亚群禽白血病病毒血清抗体与卵黄抗体的变化动态及其相关性

为研究以卵黄抗体替代血清抗体判定SPF鸡群J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染状态的可行性,人工接种ALV-J的SPF鸡23周龄时,分别从25只抗体阳性鸡及22只抗体阴性鸡采集血清和卵黄,比较不同稀释度的卵黄与血清中ALV-J抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄1∶400稀释,假阳性和假阴性最少,确定1∶400为卵黄最适稀释度。对40只攻毒SPF鸡和36只同批次单独饲养的空白SPF鸡在25~34周龄,每隔3周采集一次血清,每周采集一次种蛋,共采集304份血清样品和760份卵黄样品。血清按1∶500稀释,卵黄按1∶400稀释,所有血清和卵黄抗体用美国IDEXX公司ALV-J抗体ELISA检测试剂盒检测,同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品严格在同一次ELISA中检测。结果显示,在25~34周龄,卵黄抗体检测判定结果与血清整体吻合率为82.5%~95%。上述结果表明用卵黄抗体替代血清样品检测来监控SPF鸡群对ALV-J的感染状态是可行的,疫苗生产企业可通过抽检SPF鸡场提供SPF种蛋的卵黄抗体水平来判断SPF鸡场的洁净度。     

卵黄抗体代替血清抗体评价种鸡群病原感染状态的研究

为了解卵黄抗体与血清抗体间的相关性,分别采集一定数量的莱芜黑鸡、海兰褐蛋种鸡和SPF白来航鸡的血清、鸡蛋,所有鸡蛋与血清样品均一一对应。用禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、呼肠孤病毒(REOV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、AB亚群禽白血病病毒(ALV-AB)、禽传染性贫血病毒(CAV)以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)等6种ELISA检测试剂盒,分别检测血清与卵黄中的抗体水平,用SPSSStatistics17.0程序比较分析血清与卵黄抗体OD值的相关系数,从而获得针对ELISA检测卵黄抗体的最佳稀释倍数。结果显示,23~38份卵黄样品中REV、REOV、ALV-J、ALV-AB、CAV以及IBDV的抗体检测最佳稀释比例分别为1∶200、1∶400、1∶250、1∶200、1∶20和1∶500,与血清中抗体OD值的相关系数分别为0.982、0.939、0.927、0.993、0.935和0.989;检测结果还表明,最佳稀释度卵黄与血清样品的阴阳性符合率为96%~100%。本研究显示,卵黄可代替血清样品用ELISA检测试剂盒检测,以判断种鸡群的病原感染状态。     

卵黄抗体检测评估SPF鸡对鸡传染性贫血病病毒的感染状态研究

鸡传染性贫血病病毒(CIAV)是禽弱毒疫苗中常见外源病毒之一,选择未被CIAV污染的SPF鸡胚是生产合格疫苗的关键环节,疫苗生产企业通常通过检测SPF鸡血清中CIAV的抗体来评估CIAV感染状况,本研究以取样更为方便的卵黄抗体检测来评估SPF鸡群中CIAV感染状态。将40只SPF鸡于19周龄时人工接种CIAV,同时30只SPF鸡饲养于另一隔离环境内作为空白对照。23周龄时每只鸡分别采集种蛋和血清并一一对应,然后将卵黄分别进行1∶10、1∶20、1∶30稀释后与血清同时检测CIAV抗体,结果发现卵黄抗体1∶20倍稀释后判定结果与血清抗体吻合率最高。对70只SPF鸡从25~34周龄进行连续10周观察,结果显示卵黄抗体检测结果与血清抗体检测结果吻合率达91.57%。建议疫苗生产企业可通过抽检卵黄抗体来判断SPF鸡群的CIAV洁净度。     

SPF鸡感染网状内皮组织增生症病毒后血清和卵黄的抗体反应相关性比较

为进一步研究采用卵黄抗体检测代替血清抗体检测的可行性,采用已建立的卵黄抗体ELISA检测方法,比较同一时期卵黄抗体与血清抗体的相关性。人工感染23周龄无特定病原体（SPF）鸡,每周采集全血分离血清,每天收集种蛋,ELISA方法检测血清、种蛋中的REV抗体,并进行比较,结果表明：攻毒后第2周开始血清抗体和卵黄抗体呈阳性,并达到峰值,之后抗体水平缓慢下降,两者具有相似的消长规律;对同一时期的卵黄抗体和血清抗体S/P比值进行统计学比较,P值小于0.05,相关系数为0.931,表明两者差异性不显著,相关性很好;阴阳性符合率比较,阳性符合率为97.8%,阴性符合率为100%,总体符合率为98.4%,阴阳性复合率很高。试验证明,同一时期的卵黄抗体和血清抗体的相关性很好,可用卵黄抗体检测方法代替血清抗体检测,从而为监测SPF鸡群感染REV提供新的技术手段。     

ELISA法检测种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒抗体的研究

为研究种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒(REV)抗体的检测方法,运用IDEXX公司的REV抗体ELISA检测试剂盒,比较了不同提取方法、不同稀释倍数、不同洗液对卵黄中REV抗体检测结果的影响。结果显示:当用直接提取的卵黄液做300倍稀释检测,用含0.05%吐温-20的蒸馏水洗涤时,卵黄抗体的S/P比值与相应鸡群的血清抗体的S/P比值吻合度最高。应用本方法分别对50枚SPF种蛋和50枚普通鸡蛋进行检测,SPF种蛋均为REV抗体阴性;普通鸡蛋有4枚为REV抗体阳性,阳性率为8%。实验表明,种蛋卵黄ELISA抗体检测法可以代替传统血清抗体检测,为SPF鸡群的REV感染监测奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

建立了一种检测鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)抗体终点滴度(end-point titer, ET)的间接ELISA方法，以应用于监测鸡免疫疫苗或者感染野毒后的抗体。以大肠杆菌表达的IBV核衣壳(N)蛋白作为包被抗原，以SPF鸡血清和感染IBV的SPF鸡血清分别作为阴性血清和阳性血清对照，优化确定出ELISA的各项技术参数。对66份SPF鸡血清进行测试，确定了阴、阳性S/P临界值为0.385。特异性试验表明包被抗原与其他常见病原的阳性血清均不发生交叉反应，批内和批间重复性试验的变异系数均小于10.00%。选取了50份临床血清样品，通过阳性-阴性阈值(positive negative threshold, PNT)基线确定ET值，建立了固定血清稀释倍数(1∶500)处S/P值与ET的线性回归方程，相关系数(R²)为0.959 3(P<0.000 1)。通过检测2个商品鸡群在1～49日龄不同时间点采集的461份血清样本，比较了建立的IBVN-ELISA方法与IDEXX公司提供的商品化试剂盒。本研究建立的I...     

一致性检验比较牛口蹄疫病毒抗体LBE检测试剂盒

用660份牛血清比较牛口蹄疫病毒O型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的一致性,并用u检验排除抽样误差的影响。结果表明:待检血清最终稀释度数为1∶64时O型试剂盒联合检出523份口蹄疫抗体阳性和102份阴性,符合率为94.70%,结果一致性为极强(Kappa值=0.82);待检血清最终稀释度数为1∶128时O型试剂盒联合检出476份口蹄疫抗体阳性和125份阴性,符合率91.06%,结果为高度一致(Kappa值=0.75);血清最终稀释度数为164时A型试剂盒联合检出498份口蹄疫抗体阳性和120份阴性,符合率为93.64%,结果一致性为极强(Kappa值=0.81),血清最终稀释度数为1∶28时A型试剂盒联合检出354份口蹄疫抗体阳性和233份阴性,符合率为88.94%,结果为高度一致(Kappa值=0.77)。在不同包被方式下,LBE试剂盒检测待检血清牛口蹄疫病毒抗体结果一致性较好。兽医实验室可应用一致性检验,结合本单位人力、财力和物力等条件,选择适宜的牛口蹄疫病毒抗体检测试剂盒。     

多次油苗免疫刺激禽白血病内源性抗体的表达研究

本试验将200只SPF鸡分为免疫组和非免疫组两组,在4周龄时混入HBD祖代鸡群2个批次,100只/组。将SPF鸡均匀的分布到5个鸡舍,每组每舍20只。免疫组的SPF鸡均按照祖代鸡的免疫程序进行油苗、活苗免疫;非免疫组不进行油苗免疫,仅免疫活苗。分别在9、19、26、30、34周龄采集SPF免疫组和非免疫组的血清,检测ALV-J、ALV-AB的抗体。SPF免疫组和非免疫组ALV抗体的差异显著性分析结果显示:在HBD祖代鸡群ALV-AB和ALV-J亚型抗体水平正常的情况下,随着油苗免疫次数的增加,SPF免疫组和非免疫组在26周龄时的ALV-J和ALV-AB亚型的抗体水平均差异极显著(P0.001),在19周龄和34周龄均有不同程度的差异。混入的HBD祖代鸡群的种蛋禽白血病(ALV)p27和病原检测均为阴性,不存在水平传播的情况。这说明经多次油苗免疫刺激后,鸡只携带的内源性ALV诱导产生的抗体能被ALV-AB和ALV-J亚型检测试剂盒所检测到。     

ELISA检测卵黄和血清中禽呼肠孤病毒抗体相关性试验

本试验通过选取氯仿抽提卵黄抗体方法,经ELISA检测鸡卵黄和血清中禽呼肠弧病毒(REOV)抗体的相关性试验,确定卵黄抗体和血清抗体的对应关系,并依此建立ELISA试剂盒检测卵黄抗体的检测方法及判定标准.试验结果显示,采用REOV-ELISA检测试剂盒检测鸡血清及对应卵黄中REOV抗体二者具有良好的相关性,相对于血清ELISA检测法,所选样本206份中,检测结果相符的样本有200份,卵黄ELISA检测法的符合率为97.08％,表明可以采用检测血清的REOV-ELISA试剂盒检测卵黄中的REOV抗体水平.     

伪狂犬病毒中和抗体与gB-ELISA抗体阻断率之间的相关性

为了测定伪狂犬病毒中和抗体与gB抗体之间的相关性,本试验用216份伪狂犬病毒中和抗体阳性血清,对每一份样本作4种不同的稀释(1:1、1:20、1:40、1:80),用Idexx公司的gB-ELISA试剂盒检测.试验结果表明:216份中和抗体阳性血清样品中,有7份gB抗体阴性,阳性检出率为97.8%(209/216);随着中和抗体效价的增高gB-ELISA OD650值降低;gB抗体阻断率随中和抗体效价的增高而增加;对同一份血清样本作1:1、1:20、1:40、1:80稀释,测定结果发现,随着稀释度的增加,gB抗体阻断率逐渐降低,而gB-ELISA OD650值逐渐升高.     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法建立与应用

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是目前引起我国猪急性肠炎并水样腹泻的重要病原之一,但尚无商品化病毒血清抗体检测试剂盒。本研究以纯化的PEDV为包被抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了间接ELISA抗体检测方法,其反应条件为:抗原最佳包被浓度为3μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,包被时间为37℃作用2 h,1.5%BSA 37℃封闭3 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用30 min,抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性,OD450nm≤0.268判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测6份已知PEDV阳性血清效价为1∶3 200,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复试验变异系数2.5%～8.3%,对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,证明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立与临床应用

为建立1种禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)抗体检测方法,试验对AEV VP1蛋白进行截短表达,以表达蛋白为包被抗原建立检测AEV抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组VP1蛋白以包涵体形式表达,大小为34 kDa;可与AEV阳性血清发生特异性反应;以VP1蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测ALV、IBDV、IBV、ILTV、NDV、AIV-H9阳性血清均为阴性;检测AEV抗体的最低检出效价为1∶51 200;与IDEXX试剂盒的符合率为95.24%;检测新疆地区1 127份AEV疫苗免疫鸡血清样品和879份未免疫鸡血清样品的免疫抗体阳性率和感染抗体阳性率分别为88.91%和8.19%。结果表明,建立的间接ELISA方法特异、敏感、准确,可用于临床中免疫抗体和野毒感染抗体的检测和筛查。     

传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法的建立

为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。     

鸡传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒的研究

利用鸡传染性支气管炎M41株病毒研制了检测鸡传染性支气管炎抗体的ELISA试剂盒。抗原最佳包被浓度为0．973ug／ml，被检血清最佳稀释度为1：200，酶标结合物最适工作浓度1：1200，血清样品阴阳性临界值为0．184。本试剂盒和Aflfinitech的IB试剂盒同时检测56份血清样品，比较结果表明本试剂盒的特异性和敏感性分别为100％和88％。试剂盒保存期试验结果表明，试剂盒可保存6个月。     

禽白血病p27抗原检测阳性与病毒分离的相关性比较

本试验以80只300日龄的A品系蛋鸡为试验对象,分5个日龄段按翅号采集蛋清、泄殖腔棉拭子,无菌抗凝血和血清.用ALV p27抗原检测试剂盒检测蛋清和泄殖腔棉拭子.将无菌抗凝血分离血浆接种DF-1细胞,培养一周后用同样方法检测上清收集液,分析该群鸡只在不同日龄段泄殖腔棉拭子阳性、蛋清样本阳性和病毒分离阳性之间的相关性.用ALV-Ab抗体试剂盒检测各日龄段血清的抗体水平.此外,选取某一日龄段蛋清和泄殖腔拭子样本用4个不同厂家的ALV p27抗原检测试剂盒进行检测比较.结果表明,5个日龄段泄殖腔棉拭子平均阳性率为61％,蛋清样本平均阳性率为72.6％,病毒分离平均阳性率为48.8％.5个日龄段ALV的抗体阳性率一直为零;4个厂家的ELISA试剂盒对同一批样本的检测结果表明,IDEXX试剂盒的敏感度最高.本试验为外源性鸡白血病病毒检测及鸡白血病净化其方法的应用、试剂盒的选择、减少判定的误差、提高净化效果提供了一定的科学依据.     

口蹄疫病毒A型竞争ELISA抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用

为评价口蹄疫病毒A型竞争ELISA(cELISA)抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用前景,对2017年从福建省三明市采集的336份黄牛、奶牛、羊和猪血清样品,用A型cELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。结果显示,92份黄牛血清、92份羊血清、92份猪血清、60份奶牛血清的A型抗体阳性率分别为13.04%、11.96%、20.65%、86.67%。从上述4种血清中,各挑选10份血清(阴性、阳性各5份)共40份,采用口蹄疫病毒液相阻断ELISA(LPB-ELISA)抗体检测试剂盒进行验证。结果显示:cELISA检测为阳性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阳性19份;cELISA检测为阴性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阴性17份;两种方法的κ值为0.8,总符合率为90.00%。结果表明,A型cELISA试剂盒与LPB-ELISA试剂盒的符合率和一致性均较高,可用于口蹄疫流行病学调查和血清学监测。     

小鼠肝炎病毒抗体ELISA和IFA检测试剂盒真实性评价

为评价小鼠肝炎病毒(MHV)抗体ELISA和IFA检测试剂盒的真实性,选择两种进口MHV抗体ELISA和IFA试剂盒检测26份小鼠血清,并对检测结果进行对比评价。检测结果显示,26份血清中,13份两种试剂盒检测的结果全为阳性,11份全为阴性,剩余2份分别为ELISA阳性、IFA阴性。评价结果显示,参比IFA,ELISA试剂盒灵敏度为100%,特异度为84.61%,误诊率为15.38%,漏诊率为0,准确度为92.30%,正确指数为0.846,阳性似然比为650%,阴性似然比为0。结果初步证实,ELISA试剂盒配合IFA试剂盒适用于MHV抗体的日常监测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp4抗体ELISA检测方法的建立

克隆、表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒DY株(GenBank:JN864948)的Nsp4蛋白,并利用Nsp4作为包被蛋白建立了ELISA检测方法。优化的Nsp4抗体ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为1μg/mL,血清最佳稀释度为1∶40,最佳封闭液为100mL/L牛血清,酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶4000,最佳显色时间为37℃反应15min。用建立的ELISA检测方法和IDEXX ELISA检测试剂盒检测血清样品130份,总符合率为93.19%。Nsp4抗体ELISA检测方法的建立,可为PRRSV的抗体监测提供技术支持。     

猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法，本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠，按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体，PEDV细胞培养上清为夹心抗原，HRP标记的羊抗猪IgA为二抗，采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法，并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测，结果显示，除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外，其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性，表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测，结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40 960，是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2 560)，表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性...     

伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立伪结核棒状杆菌(Cp)血清抗体间接ELISA检测方法,以热灭活处理的不同的浓度Cp菌株作为固相抗原包被酶标板,用不同封闭液封闭,设置不同的封闭时间,再用不同稀释度的待检血清和不同稀释度的酶标二抗与之反应,以此优化间接ELISA反应条件,确定阳性临界值。对间接ELISA方法的特异性和重复性进行试验,并在此基础上对采集的临床样本进行检测。结果显示,最佳抗原包被量为OD600 nm=0.084的菌悬液100μL,10 g/L BSA封闭时间2 h,一抗血清稀释度为1∶400,酶标二抗的稀释度为1∶5 000,血清阴阳性的OD450 nm值临界值为0.352。该方法仅对Cp阳性血清呈特异性反应,与6种常见病原阳性血清均无交叉反应,特异性较强。批内试验和批间试验的变异系数均小于9.5%,重复性较好。敏感性试验结果表明,当伪结核标准阳性血清进行1∶1 280稀释时检测仍为阳性,敏感性较强。用该方法对10份经细菌分离鉴定为阳性的血清进行Cp抗体检测,结果均为阳性。用建立的方法对临床随机采集的423份血清进行检测,结果显示阳性率为35%。研究建立的抗体间接ELISA方法为Cp抗体检测及血清学调查奠定了基础。