ELISA法检测种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒抗体的研究

为研究种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒(REV)抗体的检测方法,运用IDEXX公司的REV抗体ELISA检测试剂盒,比较了不同提取方法、不同稀释倍数、不同洗液对卵黄中REV抗体检测结果的影响。结果显示:当用直接提取的卵黄液做300倍稀释检测,用含0.05%吐温-20的蒸馏水洗涤时,卵黄抗体的S/P比值与相应鸡群的血清抗体的S/P比值吻合度最高。应用本方法分别对50枚SPF种蛋和50枚普通鸡蛋进行检测,SPF种蛋均为REV抗体阴性;普通鸡蛋有4枚为REV抗体阳性,阳性率为8%。实验表明,种蛋卵黄ELISA抗体检测法可以代替传统血清抗体检测,为SPF鸡群的REV感染监测奠定了基础。     

SPF鸡感染J亚群禽白血病病毒血清抗体与卵黄抗体的变化动态及其相关性

为研究以卵黄抗体替代血清抗体判定SPF鸡群J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染状态的可行性,人工接种ALV-J的SPF鸡23周龄时,分别从25只抗体阳性鸡及22只抗体阴性鸡采集血清和卵黄,比较不同稀释度的卵黄与血清中ALV-J抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄1∶400稀释,假阳性和假阴性最少,确定1∶400为卵黄最适稀释度。对40只攻毒SPF鸡和36只同批次单独饲养的空白SPF鸡在25~34周龄,每隔3周采集一次血清,每周采集一次种蛋,共采集304份血清样品和760份卵黄样品。血清按1∶500稀释,卵黄按1∶400稀释,所有血清和卵黄抗体用美国IDEXX公司ALV-J抗体ELISA检测试剂盒检测,同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品严格在同一次ELISA中检测。结果显示,在25~34周龄,卵黄抗体检测判定结果与血清整体吻合率为82.5%~95%。上述结果表明用卵黄抗体替代血清样品检测来监控SPF鸡群对ALV-J的感染状态是可行的,疫苗生产企业可通过抽检SPF鸡场提供SPF种蛋的卵黄抗体水平来判断SPF鸡场的洁净度。     

SPF鸡感染禽白血病病毒A/B亚群后血清抗体与卵黄抗体的变化及其相关性

拟研究以卵黄抗体替代血清抗体检测判定SPF鸡群禽白血病病毒(ALV)感染状态的可行性。在人工接种ALV-A/B后的40只SPF鸡刚开产时,从21只抗体阳性鸡及19只抗体阴性鸡分别采集血清和卵黄并一一对应,比较卵黄不同稀释度与血清中ALV-Ab抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。另外36只同批次不攻毒的SPF鸡单独饲养作为对照,76只鸡在25~34周龄期间,每隔3周分别采集1次血清,每周采集1次种蛋,共采集了304份血清样品及836份卵黄样品。所有血清和卵黄抗体用IDEXX的ALV-Ab抗体ELISA检测试剂盒检测。血清按试剂盒规定的1∶500稀释,卵黄按预试验结果选定稀释度稀释。同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品,严格在同一次ELISA试验中检测。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄做1∶300稀释时,假阳性和假阴性最少,确定1∶300为卵黄最适稀释度。在25~34周龄,836份卵黄抗体的检测判定结果与304份血清抗体检测结果吻合率达94.7%,即这些血清抗体阳性鸡同时期采集的卵黄抗体也全部阳性,血清阴性鸡的卵黄抗体也均为阴性。结果提示疫苗生产企业可通过检测SPF种蛋的卵黄抗体来判断SPF鸡场对ALV的洁净度。     

卵黄抗体代替血清抗体评价种鸡群病原感染状态的研究

为了解卵黄抗体与血清抗体间的相关性,分别采集一定数量的莱芜黑鸡、海兰褐蛋种鸡和SPF白来航鸡的血清、鸡蛋,所有鸡蛋与血清样品均一一对应。用禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、呼肠孤病毒(REOV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、AB亚群禽白血病病毒(ALV-AB)、禽传染性贫血病毒(CAV)以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)等6种ELISA检测试剂盒,分别检测血清与卵黄中的抗体水平,用SPSSStatistics17.0程序比较分析血清与卵黄抗体OD值的相关系数,从而获得针对ELISA检测卵黄抗体的最佳稀释倍数。结果显示,23~38份卵黄样品中REV、REOV、ALV-J、ALV-AB、CAV以及IBDV的抗体检测最佳稀释比例分别为1∶200、1∶400、1∶250、1∶200、1∶20和1∶500,与血清中抗体OD值的相关系数分别为0.982、0.939、0.927、0.993、0.935和0.989;检测结果还表明,最佳稀释度卵黄与血清样品的阴阳性符合率为96%~100%。本研究显示,卵黄可代替血清样品用ELISA检测试剂盒检测,以判断种鸡群的病原感染状态。     

鹦鹉热嗜性衣原体感染SPF鸡和污染相关疫苗的初步调查

为初步调查SPF鸡感染鹦鹉热嗜性衣原体状况及相关SPF鸡胚源疫苗是否出现污染,本试验通过采集不同日龄的SPF鸡血清70份、SPF种蛋卵黄膜30份,收集市场上销售的SPF鸡胚源疫苗共41支,利用国产间接血凝试剂盒检测抗体,进口免疫荧光试剂盒分别测定其抗体、抗原阳性率,以评价SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体的流行状况和相关疫苗的污染状况。本试验结果显示,SPF鸡血清阳性率分别为31.4%(荧光法)、5.7%(间接血凝法);SPF种蛋阳性率33.3%,SPF鸡胚源疫苗平均阳性率31.7%。SPF鸡已经感染了鹦鹉热嗜性衣原体,且发现经鸡胚卵黄膜而传播病原的新途径,进而造成SPF鸡胚源疫苗出现衣原体污染。因此,加强SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体监测已势在必行。     

运用实时荧光PCR法检测感染鸡种蛋中的REV

为研究通过种蛋检测的方法监测SPF鸡群REV感染情况，运用已建立的荧光定量PCR方法检测攻毒母鸡种蛋中REV，并与血清REV水平进行比较。人工感染12月龄母鸡，从种蛋中提取蛋清，接种正常鸡胚成纤维细胞后传代一次，之后石蜡密封孵化至9日龄制成鸡胚成纤维细胞（CEF），运用荧光定量PCR方法检测蛋清，并和血清的检测结果进行比较，结果显示：83份蛋清，3份REV阳性；46份CEF，2份REV阳性，均在攻毒后的11天、14天收集，阳性样品的蛋清和CEF呈对应关系，两种方法的检测结果一致。与血清检测结果比较：阳性鸡蛋均在血清病毒血症持续的时间内采集，表明通过种蛋REV检测能反映SPF鸡的急性感染状态。本研究为通过种蛋抗原检测从而监测SPF鸡REV感染奠定基础。     

卵黄抗体检测评估SPF鸡对鸡传染性贫血病病毒的感染状态研究

鸡传染性贫血病病毒(CIAV)是禽弱毒疫苗中常见外源病毒之一,选择未被CIAV污染的SPF鸡胚是生产合格疫苗的关键环节,疫苗生产企业通常通过检测SPF鸡血清中CIAV的抗体来评估CIAV感染状况,本研究以取样更为方便的卵黄抗体检测来评估SPF鸡群中CIAV感染状态。将40只SPF鸡于19周龄时人工接种CIAV,同时30只SPF鸡饲养于另一隔离环境内作为空白对照。23周龄时每只鸡分别采集种蛋和血清并一一对应,然后将卵黄分别进行1∶10、1∶20、1∶30稀释后与血清同时检测CIAV抗体,结果发现卵黄抗体1∶20倍稀释后判定结果与血清抗体吻合率最高。对70只SPF鸡从25~34周龄进行连续10周观察,结果显示卵黄抗体检测结果与血清抗体检测结果吻合率达91.57%。建议疫苗生产企业可通过抽检卵黄抗体来判断SPF鸡群的CIAV洁净度。     

ELISA检测卵黄和血清中禽呼肠孤病毒抗体相关性试验

本试验通过选取氯仿抽提卵黄抗体方法,经ELISA检测鸡卵黄和血清中禽呼肠弧病毒(REOV)抗体的相关性试验,确定卵黄抗体和血清抗体的对应关系,并依此建立ELISA试剂盒检测卵黄抗体的检测方法及判定标准.试验结果显示,采用REOV-ELISA检测试剂盒检测鸡血清及对应卵黄中REOV抗体二者具有良好的相关性,相对于血清ELISA检测法,所选样本206份中,检测结果相符的样本有200份,卵黄ELISA检测法的符合率为97.08％,表明可以采用检测血清的REOV-ELISA试剂盒检测卵黄中的REOV抗体水平.     

伊犁河谷地区父母代种鸡场REV与鸡白痢流行病学调查

为掌握伊犁河谷地区不同来源黄羽父母代肉种鸡网状内皮组织增生病病毒(REV)与鸡白痢流行情况,为父母代肉种鸡场引种提供重要依据。本研究通过酶联免疫吸附实验(ELISA)方法和鸡白痢伤寒沙门氏菌血清平板凝集实验,从6家种鸡场采集5个不同来源的父母代肉种鸡种公鸡血样879份,进行REV血清抗体检测及鸡白痢检测。结果:不同来源父母代肉种公鸡REV群体血清抗体阳性率为100%,个体血清抗体阳性率为7.41%～19.10%,平均血清抗体阳性率为14.79%。鸡白痢群体阳性率为100%,个体阳性率为20.83%～54.10%,平均阳性率为31.63%。混合感染样品52份,混合感染阳性率5.92%。说明REV与鸡白痢的感染具有相关性,可能与不同来源祖代场对REV和鸡白痢的净化重视程度有关。鸡群感染REV时,鸡白痢易感性增高,这与REV可引起免疫抑制的特性相符。     

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示：(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21～70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊...     

鸡抗REV血清的制备与检定

用网状内皮组织增生症病毒（REV）HA9901株免疫SPF鸡,无菌采血制备鸡抗REV血清。通过ELISA、IFA、AGP、HI等方法对制备的血清进行检测,未检出禽类常见的其他17种（或亚型）病毒的抗体,该血清具有良好的特异性。通过测定,该血清用于间接免疫荧光试验（IFA）的效价为1：2000,用于IFA检测REV的染色效果与REV单抗（11818和11854的混合物）相当。试验结果表明,该批血清1000倍稀释可作为一抗,用于REV的间接免疫荧光检测。     

血清中IBV特异性IgG及总IgG含量变化规律的研究

本研究采用间接酶联免疫吸附试验对人工感染鸡传染性支气管炎病毒的SPF鸡血清中特异性抗体及总IgG含量进行检测并比较其相关性.结果表明感染IBV-M41第1 d、3 d、5 d、7 d、10d、14d、21 d、28 d的血清中特异性抗体水平随感染天数增加而升高,于第14天达到最高,之后略呈降低趋势,与健康对照比较差异显著(P＜0.01);总IgG含量较健康对照组增幅小,差异显著(P＜0.01).同时,两者的消长趋势基本一致.     

鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白（Mature chicken interleukin-18,mChIL-18）的2株单克隆抗体（mAb）1G9和2E6,建立检测mChlL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg／L,检测抗体的工作效价为1：800,待检样品的最佳稀释度为1：400,检测敏感度可达31．5ng／L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著（P〈0．05）。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。     

禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF雏鸡法氏囊细胞Bcl-2和C-myc基因表达及凋亡的影响

【目的】 探究禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染禽类后导致免疫器官发生细胞凋亡的机理。【方法】 以1日龄SPF雏鸡为试验对象,将100只SPF雏鸡随机均分为REV感染组和未感染病毒的对照组,REV感染组雏鸡经腹腔感染500 μL REV稀释液,对照组雏鸡经相同途径注射等量灭菌生理盐水,于病毒感染后第1、7、14、21、28和42天,2组雏鸡随机各抽取5只,心脏采血处死雏鸡后快速摘取法氏囊。分别应用HE染色和病理切片成像系统测定分析法氏囊细胞核浆比,TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒测定凋亡细胞数,免疫组化法测定Bcl-2和C-myc阳性细胞数量,实时荧光定量PCR和ELISA法分别检测法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达和蛋白含量。【结果】 ①REV感染1日龄SPF雏鸡后21~42 d,其法氏囊淋巴细胞凋亡百分比显著或极显著高于对照组雏鸡(P<0.05;P<0.01);②SPF雏鸡感染REV后21和28 d,其法氏囊细胞核浆比显著低于对照组雏鸡(P<0.05);③REV感染SPF雏鸡法氏囊中Bcl-2和C-myc阳性细胞数在病毒感染后21和28 d显著高于对照组雏鸡(P<0.05);④REV感染SPF雏鸡后21 d,其法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达极显著高于对照组雏鸡(P<0.01)。⑤SPF雏鸡感染REV后,其法氏囊中Bcl-2蛋白含量较对照组雏鸡有不同程度的增加,其中21和28 d分别差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05),病毒感染组雏鸡的C-myc蛋白含量也始终高于对照组雏鸡,且21和28 d极显著增高(P<0.01)。【结论】 REV感染所致SPF雏鸡法氏囊细胞Bcl-2和C-myc的mRNA表达以及蛋白含量异常均与病毒感染导致的法氏囊细胞凋亡密切相关,而法氏囊细胞凋亡数量增加与REV感染引发的机体免疫机能抑制密切相关。     

CAV与REV共感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

用1日龄SPF鸡人工感染鸡贫血病毒(CAV)和禽网状内皮增生病病毒(REV),探讨病毒感染对鸡体疫苗免疫反应的影响。结果表明,在用禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗免疫后,CAV与REV单独感染均显著抑制了鸡体对H5和H9亚型禽流感病毒灭活疫苗的HI抗体反应,在CAV与REV共感染后,这种抑制作用更为明显。CAV单独感染后鸡体对新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗的免疫反应受到抑制,但与对照组在统计学上的差异不显著,然而,CAV可以显著加重REV感染对鸡体在NDV和IBDV疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。从而证实CAV与REV共感染在疫苗免疫抑制上有协同作用。     

Monoclonal-antibody-mediated enzyme-linked immunosorbent assay for detection of reticuloendotheliosis viruses

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is described for the detection of reticuloendotheliosis viruses (REVs). The assay uses a mixture of monoclonal antibodies (MCAs) prepared against a 62-kilodalton REV envelope glycoprotein (gp62) to capture antigen, rabbit anti-REV serum as detection antibody, and peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG as indicator antibody. The MCAs were reactive with REV strain T, chick syncytial virus, and duck infectious anemia virus but unreactive against Marek's disease and avian leukosis viruses. The ELISA was compared with complement fixation test and REV immunofluorescent assay of infected fibroblasts, plasmas, and egg albumen from infected chickens. The lower limit of gp62 detection was about 120 ng of REV protein. Limit dilution of infectious REV was detected after 7-8 days of cultivation of infected fibroblasts.     

Effects of reticuloendotheliosis virus and Marek's disease virus infection and co-infection on IFN-gamma production in SPF chickens

Two experiments were used to examine the potential role of IFN-gamma in chickens infected with reticuloendotheliosis virus (REV) and Marek's disease virus (MDV). First, chickens were infected with REV and/or MDV at 5 days of age and examined from 3 to 50 days post-infection (dpi). In REV+MDV co-infection chickens, IFN-gamma ELISA demonstrated a 3-fold increase at 7 dpi compared to the controls, while REV alone caused a 5-fold increase, the IFN-gamma levels peaked, and then gradually decreased. IFN-gamma levels significantly decreased in MDV infection at 3 dpi and 15 dpi. Second, experiments were designed to determine the effects of different viruses and ConA on IFN-gamma production. For REV- or MDV-infected chickens, the IFN-gamma levels decreased slightly after adding ConA. This is the first report of IFN-gamma production in SPF chickens infected with REV and MDV measured by directly quantitative method.     

Evaluation of immune effects of fowlpox vaccine strains and field isolates

The immune effects of fowlpox virus (FPV) field isolates and vaccine strains were evaluated in chickens infected at the age of 1 day and 6 weeks. The field isolates and the obsolete vaccine strain (FPV S) contained integrated reticuloendotheliosis virus (REV) provirus, while the current vaccine strain (FPVST) carries only REV LTR sequences. An indirect antibody ELISA was used to measure the FPV-specific antibody response. The non-specific humoral response was evaluated by injection of two T-cell-dependent antigens, sheep red blood cells (SRBC) and bovine serum albumin (BSA). There was no significant difference in the antibody response to FPV between chickens infected with FPV various isolates and strains at either age. In contrast, antibody responses to both SRBC and BSA were significantly lower in 1-day-old chickens inoculated with field isolates and FPV S at 2-3 weeks post-inoculation. Furthermore, cell-mediated immune (CMI) responses measured by in vitro lymphocyte proliferation assay and in vivo using a PHA-P skin test were significantly depressed in chickens inoculated with field isolates and FPV S at the same periods. In addition, thymus and bursal weights were lower in infected chickens. These immunosuppressive effects were not observed in chickens inoculated with the current vaccine strain, FPVST, at any time. The results of this study suggest that virulent field isolates and FPV S have immunosuppressive effects when inoculated into young chickens, which appeared in the first 3 weeks post infection. REV integrated in the FPV field isolates and FPV S may have played a central role in the development of immunosuppression.     

网状内皮组织增殖病病毒感染SPF雏鸡外周血液T,B淋巴细胞数量变化

应用ＳＰＡ菌体花环法检测网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）感染ＳＰＦ雏鸡外周血液Ｔ、Ｂ淋巴细胞数量动态变化。结果发现，１日龄ＳＰＦ雏鸡感染ＲＥＶ后７～４９ｄ外周血液Ｔ淋巴细胞数量，１４～４９ｄＢ淋巴细胞数量均明显低于对照组。表明感染ＲＥＶ的ＳＰＦ雏鸡外周血液的细胞免疫和体液免疫水平均下降。     

H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫、免疫后攻毒及人工感染鸡抗体的监测

本研究采用ＡＧＰ、ＨＩ等试验方法，对经Ｈ９亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫、免疫后攻毒以及经Ｈ９Ｎ２活毒人工感染后的ＳＰＦ鸡抗体产生、消长规律进行了测定，结果表明人工感染ＳＰＦ鸡和免疫鸡一周后，ＡＧＰ的检出率即可达到１００％；Ｈ９亚型禽流感油乳剂灭活苗自免疫后一周内即可产生ＨＩ抗体，２１－２８天达到高峰，并能对相同亚型病毒感染引发良好的免疫反应。