人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

人源Nodal成熟肽的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达人Nodal成熟肽,免疫小鼠制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His6-hNodal融合蛋白,融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,回收融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法检测抗体的效价和特异性。结果:在大肠杆菌中高效表达了与预期理论值大小相符的Mr约13 000的人Nodal成熟肽的融合蛋白,通过免疫小鼠制备的多克隆抗体效价高、特异性强。结论:成功制备了抗人Nodal成熟肽多克隆抗体,为进一步深入研究Nodal在肿瘤发生发展过程中的生物学功能奠定了基础。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。     

人GALNT3-sol蛋白的原核表达和抗体制备

目的:构建人乙酰半乳糖胺转移酶3可溶性区域( GALfVI3-sol)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化GALN13 -sol蛋白,制备小鼠抗人GALIVI3-sol多克隆抗体,并对抗体的基本特性进行了检测.方法:RT-PCR扩增编码人GALIVI3 -sol的cDNA片段(1 755 bp),将其克隆至原核表达载体pET15b中,转化大肠杆菌B121( DE3)后,诱导表达人GALNr 13-aol重组蛋白.将变性、复性和电泳纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清.分别采用EL ISA和Westem blot检测抗体的效价和特异性.结果:成功构建了pET15b/CALArl3-so/原核表达载体,转BI21( DE3)后可高效表达重组蛋白GALIVI3-sol.获得的小鼠抗人GALN,l3_sol多克隆抗血清效价达1:25 600,并有良好的特异性.结论:成功获得人GALN'13-sol蛋白,得到了效价和特异性良好的小鼠抗人GALIVI3-sol抗体,为进一步研究人GALNT3在肿瘤组织中的表达提供了可靠的材料.     

鸡肺表面活性蛋白A的表达及其多克隆抗体的制备

目的表达鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)重组蛋白,并制备鼠抗cSP-A多克隆抗体。方法人工合成cSP-A的凝集素糖识别区(CRD)基因(cSP-A-CRD),亚克隆到pGEX-6P-1载体中进行原核表达,对表达产物进行鉴定。切胶纯化法纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备抗cSP-A多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法、免疫荧光组织化学染色和ELISA鉴定该抗体的特异性和适用范围。结果获得鼠抗cSP-A血清,效价达到105;Western blot法结果表明多抗血清具有良好的特异性和反应性,并可用免疫荧光组织化学技术检测鸡肺上皮细胞表达的cSP-A和用间接ELISA检测鸡肺灌洗液中存在的水溶性cSP-A蛋白。结论成功表达了cSP-A重组蛋白并制备了小鼠抗cSP-A多克隆抗体。     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆小鼠TIM-3基因,构建原核表达载体,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法:以小鼠脾细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3基因编码区,构建pRSET-B-TIM-3原核表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;然后常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,用Western blot、免疫组化、流式细胞术检测抗体的特异性。结果:成功构建的原核表达载体pRSET-B-TIM-3在大肠杆菌中诱导后可以高效表达TIM-3蛋白;免疫获得的多克隆抗体经过ELISA检测,抗体效价为1∶320 000,经Western blot、免疫组化和流式细胞术等鉴定,抗体的特异性较好。结论:成功克隆出小鼠的TIM-3基因,构建了原核表达载体,制备的兔抗小鼠TIM-3多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。     

抗棉铃虫Ⅳ型几丁质酶(HaCHT4)小鼠多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达棉铃虫Ⅳ型几丁质酶(HaCHT4)并制备其多克隆抗体。方法在大肠杆菌中表达组蛋白-HaCHT4融合蛋白(His-HaCHT4),镍柱纯化目的蛋白,经足垫加皮下注射免疫小鼠。4次免疫后,用ELISA检测抗His-HaCHT4多克隆抗体的效价,Western blot法检测其免疫特异性。结果成功纯化His-HaCHT4融合蛋白,小鼠抗His-HaCHT4的多克隆抗体的滴度高于1∶204 800。Western blot结果显示该抗体能与His-HaCHT4融合蛋白及棉铃虫体中的天然HaCHT4结合,但不能与黄粉虫的蛋白结合。结论成功原核表达和纯化了His-HaCHT4,制备了特异性的鼠多克隆抗体。     

釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定

目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin), 制备多克隆抗体, 并进行初步鉴定.方法:RT-PCR获得Amelotin成熟肽片段, 构建pET32a-Amelotin, IPTG诱导表达Amelotin, 纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, ELISA检测抗体滴度.Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔, 得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1:12 800.Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin, 免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用.结论:以纯化的Amelotin为免疫原, 成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelotin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础.     

抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备小鼠抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b的多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:合成H1b特异性多肽,以匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏小鼠,制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价,通过Western blot和免疫组织化学检测,鉴定抗体的特异性与适用范围.结果:得到小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,效价达1:105.纯化后的抗体用于Western blot可高特异性识别真核表达的H1b蛋白,并可用于免疫组织化学实验.结论:成功制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,该抗体具有较高的效价以及特异性,能区分ASG-PR大亚基的两种剪接异构体,从而为进一步研究H1b蛋白的生理功能及其在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Nono(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein)融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a( )-Nono重组表达质粒,转入Rosetta(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a( )-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化小鼠源性含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)蛋白的C段(1109-1213),制备兔抗ADAMTS2多克隆抗体。方法以重组质粒p GEX-6p-1-ADAMTS2(1109-1213)转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过亲和纯化,并且经质谱鉴定;以表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ADAMTS2的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性。结果在大肠杆菌中表达出目的蛋白ADAMTS2,纯化后经质谱鉴定并免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清。血清效价达到1∶160 000以上,且具有良好的特异性。结论成功制备出效价高、特异性好的兔抗ADAMTS2抗体。     

肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备

目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。     

小鼠肺炎链球菌脂蛋白SPD_1609多克隆抗体的制备

目的制备肺炎链球菌脂蛋白SPD_1609的小鼠多克隆抗体。方法通过PCR扩增肺炎链球菌D39菌株中的spd_1609基因,连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒pGEX-4T-1609。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶-SPD_1609(GST-1609)融合蛋白。利用GST亲和层析柱纯化GST-1609融合蛋白,纯化后的融合蛋白用凝血酶(thrombin)外切酶切掉GST标签,进一步通过GST亲和层析得到SPD_1609蛋白。用纯化的不含GST标签的SPD_1609蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体的效价, Western blot法检测抗体的特异性。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1609,经GST亲和层析柱分离纯化后可得到相对分子质量(M_r)35 000的SPD_1609蛋白,蛋白纯度在95%以上。ELISA检测结果显示纯化后的SPD_1609蛋白可诱导小鼠产生特异性免疫应答,免疫小鼠血清抗体的效价达1∶40 960, Western blot法检测显示此多克隆抗体可以特异地识别原核表达和肺炎链球菌细胞内表达的SPD_1609蛋白。结论成功制备具有较好特异性的SPD_1609蛋白的小鼠多克隆抗体。     

小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.