有关瘢痕形成机制研究:不同皮肤成纤维细胞对羊水的反应

目的:研究正常皮肤和胎儿皮肤成纤维细胞体外培养时对羊水的不同反应,探讨瘢痕形成的机制。方法:采用成纤维细胞体外培养技术,比较正常皮肤成纤维细胞与胎儿皮肤成纤维细胞对羊水的不同反应。结果:羊水对胎儿皮肤成纤维细胞无明显影响,刺激正常皮肤的成纤维细胞。结论:体外培养的正常皮肤成纤维细与胎儿皮肤成纤维细胞生长率相同,对羊水的反应不同。     

脾酪氨酸激酶与瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学性状改变的关系

目的：通过瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid Fibroblasts，KFB)信号传递的研究，探讨脾酪氨酸激酶(Spleen Tyrosine Kinase，Syk)与KFB生物学性状改变的关系。方法：取瘢痕疙瘩和正常皮肤，采用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养。Western Blotting检测传代早期瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞(Normal Skin Fibroblasts，NFB)中Syk的表达情况。结果：正常皮肤成纤维细胞中Syk表达减少或缺如，瘢痕疙瘩成纤维细胞中Syk表达显著增加，两者相比具有显著性差异(P=0．002，t=4．391)。结论：瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学性状的异常可能与Syk信号传递系统有关。     

人正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养及生物学差异

背景:成纤维细胞是创伤愈合过程中的主要效应细胞,对瘢痕疙瘩成纤维细胞进行培养可为体外研究瘢痕疙瘩提供基础.目的:比较体外培养的人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞生物学特性的差异,为体外研究瘢痕疙瘩提供平台.方法:应用组织微粒贴壁法,对人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞进行原代培养、传代培养、冻存及复苏,观察二者的生长增殖情况及差异.结果与结论:瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖与正常皮肤来源的成纤维细胞无明显差异,二者进入对数生长期的时间大致相同;体外培养的成纤维细胞在液氮中冻存后,细胞复苏状态良好,接种后绝大部分细胞存活,与冻存前无明显差异.说明瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞及正常皮肤来源的成纤维细胞生长增殖无明显差异,且均可成功冻存和复苏.     

胚胎无瘢痕愈合的调控机制研究：（Ⅱ）胎儿皮肤成纤维细胞体外合成胶原的实验研究

目的 探讨胶原合成特征和合成类型在胚胎成纤维细胞的表达。方法 应用^3H-脯氨酸掺入法，Ⅰ、Ⅲ型前胶原放免测定法，观察分析胎儿，成人正常皮肤，增生性瘢痕3种不同来源成纤维细胞的胶原合成情况。结果 与成人比较，胎儿成纤维细胞有更为强大的胶原合成能力（P＜0．01），和较高的Ⅲ型胶原合成比率，（Ⅰ：Ⅲ胎儿组为67％：32％，成人正常皮肤组80％：19％，增生性瘢痕为75％：24％）。结论 胎儿创伤愈合没有明显瘢痕形成，并不能归因于胶原合成的缺如，而胎儿成纤维细胞合成Ⅲ型胶原能力增高可能是胚胎创伤无瘢痕修复的内在机制。     

瘢痕组织成纤维细胞培养及其超微结构观察

目的观察不同瘢痕组织体外成纤维细胞培养其形态结构的异同.方法切取正常皮肤、增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩组织行体外成纤维细胞培养,观察其形态和超微结构.结果三类成纤维细胞大体形态学方面没有明显差异,但增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞胞质中含有发达的粗面内质网和高尔基复合体,其增殖性瘢痕成纤维细胞还含有大量肌微丝,具有肌成纤维细胞(Myofibroblast,MF)特征.结论各类瘢痕成纤维细胞在体外培养状况下,其形态学表现稍有不同.     

聚乳酸对皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的：观察种植在聚乳酸材料上的皮肤成细胞的生物学特性，为其在人工真皮中的应用打好基础。方法：将体外培养的人皮肤成纤维细胞接种到聚乳酸膜上，观察细胞在膜上的粘附、增殖，形态结构。结果：接种后的皮肤成纤维细胞在聚乳酸膜上有较高的粘附率，并且增殖良好。HE染色明显可见细胞在膜上所形成的复层化结构。结论：聚乳酸可以支持皮肤成纤维细胞的正常生长，在皮肤组织工程中有一定的应用价值。     

长波紫外线照射皮肤成纤维细胞表皮生长因子受体的表达术

背景：长波紫外线与人体皮肤老化关系密切,主要作用于表皮和真皮全层。目的：观察长波紫外线照射对体外培养的皮肤成纤维细胞的表皮生长因子受体表达的影响。方法：体外培养人成纤维细胞。将细胞分为对照组、长波紫外线照射5,10,20J／cm^2。组。照射24h后,分别用实时PCR和Westernblot检测表皮生长因子受体mRNA和蛋白的表达情况。结果与结论：体外培养的皮肤成纤维细胞随着长波紫外线照射剂量的增加,表皮生长因子受体的mRNA与蛋白水平均显著增加,提示长波紫外线可以诱导成纤维细胞星的表皮生长因子的表达。     

神经生长因子p75受体与sortilin在皮肤及瘢痕成纤维细胞中的表达**

背景：既往研究发现神经生长因子在创面愈合过程中发挥重要作用,但对于成纤维细胞中神经生长因子低亲和力受体 p75及 sortilin 的研究较少,p75及 sortilin 在瘢痕组织成纤维细胞及正常皮肤组织成纤维细胞中的表达量是否有差异目前未见报道。目的：比较神经生长因子低亲和力受体 p75及 soritilin 在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞的中表达的差异。方法：体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞,并以人永生化上皮细胞 HaCaT 为阳性对照。通过实时定量 PCR 在 mRNA 水平检测 p75及 sortilin 在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞的表达及差异,进一步通过 Western-blot 及细胞免疫化学方法观察 p75神经营养因子受体及 sortilin 在蛋白水平的表达及差异。结果与结论：实时定量 PCR 及 Western blot 结果可见,在 mRNA 及蛋白水平瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中 p75,sortilin 均呈阳性表达,其中瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中 p75及 sortilin在 mRNA 及蛋白水平表达量明显少于 HaCaT,且 p75在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中表达差异无显著性意义,sortilin 表达量在瘢痕疙瘩成纤维细胞中明显低于正常皮肤成纤维细胞(P <0.05)。免疫细胞化学结果显示 p75及 sortilin 在瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中的表达部位均位于胞膜及胞浆。由于神经生长因子前体与 p75受体高亲和力结合并在 sortilin 协助下发挥促进细胞凋亡的作用,sortilin在瘢痕成纤维细胞的表达明显低于正常皮肤成纤维细胞,可能与其高增殖状态有关,该结果为病理性瘢痕的防治提供了新的靶点。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞P53基因突变检测

目的：探讨瘢痕疙瘩体外培养成纤维细胞是否存在P53基因突变及形成发展机制。方法：对所取新鲜组织标本进行细胞培养，设计P53基因外显子4，5，6的引物序列，从所培养各组成纤维细胞中提取细胞总DNA，采用PCR技术对所需基因片段进行扩增，并对目的的基因进行测序。结果：对PCR产物DNA序列分析后发现，所有体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞（6／6）均存在P53外显子4的基因突变，有2例（2／6）P53外显子5存在基因突变，表现为点突变及移码突变，而正常皮肤成纤维细胞则未发现有任何形式的基因突变。结论：瘢痕疙瘩成纤维细胞存在P53基因突变，这可引起其细胞增殖凋亡异常。     

体内外不同环境下成纤维细胞丝裂素原激活蛋白激酶的变化

目的：观察脱离体内环境因素时成纤维细胞中信号蛋白表达及细胞生物学特性的变化。方法：瘢痕疙瘩和正常皮肤（作为阴性对照）均来自北京大学第三医院成形科手术患者各6例。取小块瘢痕疙瘩和正常皮肤组织，用组织块接种法进行成纤维细胞原代培养后，进行细胞传代。试验所用为第5-8代细胞。①评价信号蛋白的含量，用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的积分吸光度值。②评价信号蛋白的活化强度，用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的平均积分吸光度值。③评价信号蛋白的活化程度用活化率值（磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值&;#247;p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值）。结果：①p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶平均积分吸光度值比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞均低于正常皮肤成纤维细胞（0．023&;#177;0．005和0．025&;#177;0．005，0．030&;#177;0．000和0．042&;#177;0．004，P〈0．05）。②p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞p44／42丝裂原活化蛋白激酶高于正常皮肤成纤维细胞（6048．7&;#177;1576．2，3006．3&;#177;174．4，P〈0．05），瘢痕疙瘩成纤维细胞磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶与正常皮肤成纤维细胞无差异（4876．0&;#177;895．8，3966．5&;#177;533．1，P〉0．05）。③p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶活化率比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞低于正常皮肤成纤维细胞（0．830&;#177;0．134，1．319&;#177;0．156，P〈0．05）。结论：成纤维细胞在脱离生物体内环境后，其生物学特性发生改变。体外细胞培养中，磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的表达水平在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞间无明显差别，而p44／42丝裂原活化蛋白激酶的活化程度和活化强度在正常皮肤成纤维细胞明显高于瘢痕疙瘩成纤维细胞。     

体外培养不同代次人成纤维细胞超微结构观察

背景：成纤维细胞是构建组织工程化皮肤的种子细胞，通过电镜对各代细胞的超微结构进行了观察，以期为组织工程皮肤选择合适的种子细胞奠定基础。目的：观察正常人成纤维细胞体外培养过程中超微结构的改变，设计：自身对照观察。单位：潍坊医学院整形外科研究所、潍坊医学院附属医院普外科。材料：实验于2000-09／2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成。6-8岁正常男性儿童20例包皮环切术切除的健康包皮组织，均征得监护人同意自愿提供。方法：将正常人二倍体成纤维细胞进行连续传代培养，以不同代次的细胞为实验对象，通过倒置相差显微镜和透射电镜对各代细胞进行形态学及超微结构的观察。主要观察指标：①倒置相差显微镜观察的细胞的形态学改变、②透射电镜观察的成纤维细胞超微结构。结果：①倒置相差显微镜观察的细胞的形态学改变：细胞可传65～70代，成活280～300d。45代以内的细胞生长较迅速，45代后的细胞生长逐渐缓慢，65代细胞几乎无增殖趋势。②透射电镜观察的成纤维细胞超微结构：40代以内细胞的超微结构无明显变化，41～65代细胞出现核膜内折，细胞核／浆比例减小，细胞表面突起和微绒毛减少。结论：体外培养的各代成纤维细胞超微结构改变程度不同，41代后变化明显。提示构建组织工程化皮肤宜选用40代以内的成纤维细胞为种子细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子对增生性瘢痕成纤维细胞生物学特性的影响

目的：研究增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异，以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其的影响。方法：测定细胞生长曲线；应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。结果：增生性瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢；胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。bFGF对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用，对增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白的合成具有抑制作用。结论：增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞，它具有自己特殊的生物学特性。bFGF可以使增生性瘢痕成纤维细胞的生物学特性趋于正常皮肤成纤维细胞。     

表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的；观察体外培养的人皮肤角朊细胞和成纤维细胞的生物学特性，复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：分别取人皮肤角朊细胞和成纤维细胞体外培养、扩增，测定细胞生长曲线、克隆形成率和染色体倍性；将培养的角朊细胞、成纤维细胞分别接种于脱细胞真皮基质表面，体外构建组织工程皮肤，观察细胞生长增殖情况。结果：在本培养体系下人皮肤角朊细胞和成纤维细胞增殖良好，细胞染色体倍性检测结果均为二倍体细胞。脱细胞真皮基质对角朊细胞、成纤维细胞无明显毒性作用，体外复合培养细胞可生长增殖。结论：此实验方法可以获得生长状态良好的组织工程皮肤种子细胞，复合脱细胞真皮基质可成功构建组织工程皮肤     

组织工程皮肤与正常皮肤角蛋白构型的对比研究

目的：对比研究培养的组织工程皮肤与正常皮肤的角蛋白构型，探讨培养后的表皮分化情况。方法：将毛乳头细胞、真皮鞘细胞或成纤维细胞分别与鼠尾胶原混合，制成间质细胞凝胶，再在细胞凝胶表面接种角质形成细胞．体外培养2周，组织切片用15种角蛋白单抗和两种整合素α单抗进行免疫组化染色。结果：在重建的表皮中．染色。结果基本相同于正常表皮，抗原性相对要弱些，在正常表皮大多抗体可稀释数倍．而重建表皮中一般都用原液才染色较强。所不同的是RCK107在重建表皮中全表皮层弱阳性．RKSE60在表皮 真皮鞘细胞中基底层弱阳性反应。结论：在培养条件下重建的表皮相似于体内的组织学发生，角蛋白构型基本上相同于体内，但真皮鞘细胞还诱导厂低相对分子质量角蛋白表达．毛乳头细胞阻止了K10表达．说明它们与成纤维细胞还存在着功能上的差异。     

脾酪氨酸激酶与瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学性状改变的关系

目的 通过瘢痕疙瘩成纤维细胞 (Keloid Fibroblasts,KFB)信号传递的研究,探讨脾酪氨酸激酶( Spleen Tyrosine Kinase,Syk)与 KFB生物学性状改变的关系. 方法 取瘢痕疙瘩和正常皮肤,采用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养. Western Blotting检测传代早期瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞 (Normal Skin Fibroblasts, NFB)中 Syk的表达情况. 结果 正常皮肤成纤维细胞中 Syk表达减少或缺如,瘢痕疙瘩成纤维细胞中 Syk表达显著增加,两者相比具有显著性差异( P=0.002, t=4.391). 结论 瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学性状的异常可能与 Syk信号传递系统有关.     

胚胎无瘢痕愈合的调控机制研究 : (I)成纤维细胞形态和生长动力学研究

目的研究胚胎无瘢痕愈合的调控机理 . 方法应用人胚皮肤培养成纤维细胞 , 并设成人正常皮肤和增殖性瘢痕组成纤维细胞为对照 , 观测其细胞形态及生长动力学指标 . 结果与成人成纤维细胞相比 , 胎儿成纤维细胞细胞有生长速度快、分裂指数高 , DNA合成迅速和旺盛的特点 ( P均     

几丁糖对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用

目的：增生性瘢痕的成因来源于成纤维细胞的生物学特性异常，观察几丁糖对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的影响。 方法：正常皮肤、增生性瘢痕各3例，供者均系第二军医大学长海医院整形科门诊患者，均知情同意。以增生性瘢痕成纤维细胞为观察对象，正常皮肤成纤维细胞为对照，用组织块法进行不同标本成纤维细胞体外培养。根据成纤维细胞来源不同，分为正常皮肤，增生性瘢痕2组，每组再按添加几丁糖的浓度不同，分为0，0，1，0．2，0．4，0．8，1．6，2．4，4．8r,／L8组。四唑盐比色检测几丁糖对两组成纤维细胞生长增殖的影响（吸光度值变化率）；光镜与透射电镜观察几丁糖对两组成纤维细胞的形态结构的影响；^3H-脯氨酸掺人法检测几丁糖对两组成纤维细胞合成及分泌胶原功能的影响。 结果：①几丁糖对两组成纤维细胞生长增殖的影响：几丁糖能减少增生性瘢痕成纤维细胞的吸光度值；几丁糖的浓度和吸光度值改变之间存在剂量一效应关系。相同条件下增生性瘢痕组的成纤维细胞的吸光度值大于正常皮肤组（P〈0．05）；几丁糖对2组吸光度值变化率影响无显著差异（P〉0．05）。②几丁糖对两组成纤维细胞形态结构的影响：光学显微镜下，各组细胞均呈梭型，胞体较大，界限清楚，呈放射状行走。两组无明显细胞形态区别。透射电镜下，随几丁糖浓度增加，细胞内胶原，核糖体，高尔基体等减少，线粒体脊低、少。细胞功能明显受抑制，凋亡细胞增加，两组细胞形态上差异不明显。③几丁糖对两组成纤维细胞合成及分泌胶原功能的影响：随几丁糖质量浓度的增加，各组^3H-脯氨酸掺人量均逐渐减少；几丁糖相同浓度下增生性瘢痕组与正常皮肤组有非常显著性差异（P〈0．01）。增生性瘢痕组的减少率与正常皮肤组的减少率有显著性差异（P〈0．05）。 结论：几丁糖可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞的生长、增殖、合成及分泌功能，有望在增生性瘢痕的防治中发挥重要作用。     

成纤维细胞分泌胶原蛋白与5-氟尿嘧啶的时间抑制效应

目的:观察5-氟尿嘧啶干预体外培养病理性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的作用及其时效关系。方法:实验于2005-05/2006-06在安徽医科大学微生物教研室完成。①原代细胞培养成纤维细胞:手术取4例增生性瘢痕、4例瘢痕疙瘩、4例正常皮肤组织,按文献方法进行成纤维细胞原代培养,待细胞融合后传代。②取4～6代传代细胞接种于96孔板,利用四唑盐比色法测定25g/L浓度5-氟尿嘧啶干预不同时间(1,2,5,10,15,30min)后3种体外培养成纤维细胞的增殖能力,统计得出最佳时效。③利用3H-脯氨酸掺入法检测经5-氟尿嘧啶干预不同时间后成纤维细胞的胶原蛋白分泌能力。结果:①原代培养成纤维细胞全部成活,形态良好,经5-氟尿嘧啶干预后细胞形态未发生明显变化。②四甲基偶氮唑盐法测3种不同来源成纤维细胞未干预时增殖能力,瘢痕疙瘩成纤维细胞>正常皮肤成纤维细胞(t=3.542,P<0.01),增生性瘢痕成纤维细胞>正常皮肤成纤维细胞(t=3.257,P<0.01);5-氟尿嘧啶干预成纤维细胞10min与5min比较,其对成纤维细胞的抑制效果增高(正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩3种成纤维细胞10minA值依次为0.389±0.027,0.418±0.051,0.554±0.021;5minA值依次为0.537±0.033,0.589±0.074,0.783±0.015,q=3.80～4.18,P<0.05),与30min比较,差异无显著性。③干预10min3H-脯氨酸掺入量与空白对照组比较明显下降,差异有显著性(q=3.82～3.96,P<0.05),与5min干预组比较,差异均有显著性(q=3.96～4.14,P<0.05),与30min比较,差异无统计学意义。结论:5-氟尿嘧啶可有效抑制病理性瘢痕及正常皮肤来源的成纤维细胞体外增殖和胶原合成,干预10min时效应最佳。     

裸鼠模型增生瘢痕与人增生性瘢痕成纤维细胞的比较：

目的：将体外培养的模型瘢痕(analog of hypertrophic scsr，AHS)成纤维细胞与人的增生性瘢痕(human hypertrophicscar，HHS)成纤维细胞进行对比，进一步研究该模型作为HS动物模型的可行性。方法：将人全厚皮肤移植于裸鼠，建立HS动物模型，切取皮片移植后3个月时的瘢痕标本，进行成纤维细胞培养，以相应时期的HHS成纤维细胞为对照，光镜下观察成纤维细胞的形态，并分别用MTT比色法和^3H-脯氨酸掺入法测定其增殖及胶原合成活性。结果：AHS成纤维细胞与HHS成纤维细胞形态上非常相似，细胞增殖及胶原合成活性差异亦无显著性意义。结论：AHS成纤维细胞和HHS成纤维细胞非常相似，人皮肤移植增生性瘢痕裸鼠模型是一种较理想的增生性瘢痕动物模型。     

骨关节炎滑膜成纤维细胞与皮肤成纤维细胞差异性基因表达

目的比较骨关节炎滑膜成纤维细胞与皮肤成纤维细胞基因表达的差异，以进一步研究滑膜成纤维细胞在骨关节炎中的作用。方法选取骨关节炎患者滑膜，经原代培养获得滑膜成纤维细胞，采用正常志愿者原代培养皮肤成纤维细胞作为对照。使用限制性酶切片段差异展示技术分离滑膜成纤维细胞与皮肤成纤维细胞差异表达之基因。结果骨关节炎患者滑膜成纤维细胞与正常志愿者皮肤成纤维细胞相比，SOD、TFP12、CXCL2、CXCL6、TCF-β基因表达水平较高。结论SOD、TFPI2、CXCL2、CXCL5、TCF-β基因在骨关节炎滑膜成纤维细胞表达水平高于皮肤成纤维细胞中相应基因的表达水平，表明这些基因在骨关节炎疾病的发生过程中可能起到一定的作用，为进一步研究骨关节炎以及治疗骨关节炎提供了新的对象。