噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术用ＰＣＲ扩增出抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面表达技术,把Ｆａｂ段或单链抗体表达在噬菌体表面,经过“吸附－洗脱－扩增”过程筛选并富集特异性抗体。     

噬菌体抗体技术

抗体可变区的重键基因及轻链基因与线性噬菌体的包膜蛋白蛋白基因重组后,可以在噬菌体表面表达形成具有活性的抗体片段。通过抗原的直接筛选,可以分离得到特异性强,亲和力高的抗体分子,包括人抗体。本文就噬菌体抗体文库的构建,噬菌体抗体的分离及其应用作了简要介绍。     

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原(carcinoembryoni antigen, CEA)单抗的杂交瘤细胞株C50中提取总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因, 再利用两对PCR引物合成和扩增得到全单链抗体基因. 将含轻、重链可变区序列的DNA片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒pCANTAB5. 重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白. 表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集. 利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞RNA中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术是指从人外周血、脾或骨髓淋巴细胞提取总RNA,利用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）方法扩增抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术,把抗体Fab段或单链抗体表达在噬菌体表面,构建人源抗体库.噬菌体抗体将基因型（genotype）和表型（phenotype）统一于一体,将选择能力和扩增能力偶联起来,具有强大的筛选能力,能够在体外模拟体内的抗体生成过程,使抗体工程技术进入了一个新的时代.     

人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7噬菌体抗体库的构建

构建人源T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗体。从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以基因工程表达NP进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.35×107,扩增后初级库滴度为2.12×1010pfu/mL。以NP抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与NP抗原特异结合的噬菌体抗体。结果表明,研究成功构建了人源抗NP蛋白T7噬菌体抗体库。     

噬菌体呈示单链抗体表达载体及小鼠非特异抗体库的构建

用大肠杆菌丝状噬菌体表面呈示技术构建抗体库的方法,为从抗原出发获得特异抗体提供了新的途径。报道的是,首先构建了一个用于噬菌体呈示抗体的噬粒表达载体ｐＦＵＷ８０,它具有既可以进行外分明表达,又可进行附着表达的特点。然后利用设计的一套扩增小鼠抗体重链和轻链可变区基因片段的ＰＣＲ引物,从未免疫小鼠脾细胞中扩增出了抗体重、轻链可变区基因,构建了一个１．２×１０６库容的小鼠非特异性单链抗体库。从这个抗体库中,筛选出了针对人ＩｇＧ的单链抗体噬菌体,并进行了ＥＬＩＳＡ检测和部分序列分析。这一初步结果为今后继续利用这一系统进行研究奠定了基础。     

噬菌体表面展示技术

噬菌体表面展示技术是将编码外源肽或抗体的可变区ＤＮＡ 片段插入噬菌体或噬菌粒的基因组中,以融合形式与噬菌体的表面蛋白共同表达于噬菌体表面,经过“吸附———洗脱———扩增”过程筛选并富集外源肽或 特异性抗体。其中噬菌体抗体库技术可以模拟体内抗体产生和成熟过程,不经细胞杂交,甚至不经免疫制备针对任何抗原的单克隆抗体     

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定

噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录－PCR（RT PCR）、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体（ScFv）基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。     

双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建及抗GDH纳米抗体筛选

目的:构建噬菌体天然纳米抗体展示库,以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台,并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原筛选靶向GDH的纳米抗体,对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证。方法:采用Oligo DT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行反转录,通过巢氏PCR获取全套重链可变区基因,将其构建到噬菌粒pCANTAB5E载体,经多次电转化至E. coil TG1构建初级噬菌体抗体库,经辅助噬菌体拯救后构成噬菌体展示库,并对噬菌体展示库的库容及多样性进行分析和鉴定。同时以GDH为靶向抗原对文库进行淘筛,计算淘筛回收率,并对第三轮淘筛后平板的单克隆进行ELISA鉴定。结果:构建的天然噬菌体纳米抗体库的插入率为95%左右,随机挑取的9个克隆氨基酸同源性为66. 17%,经MEGA分析后具有较好的多样性,同时经辅助噬菌体拯救后,得到的噬菌体展示库滴度为4×10~(12)CFU/ml。在三轮淘筛过程中,回收率逐步升高,噬菌体得到了有效的富集,同时对阳性克隆进行测序及分析,最终得到2条抗GDH纳米抗体序列。结论:成功构建了双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库且多样性良好,为后续筛选其他的靶向抗原奠定了基础,同时筛选获得两条抗GDH纳米抗体序列,为制备艰难梭菌谷氨酸脱氢酶诊断抗体提供技术支撑。     

具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1二硫键稳定Diabody的制备

目的：对天然噬菌体抗体库进行筛选并对抗体进行体外亲和力成熟,获得高亲和力人源性抗PD-L1抗体,然后对该抗体进行二硫键稳定改造,获得具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1的二硫键稳定Diabody。方法：首先以PD-L1重组蛋白为抗原在天然噬菌体Fab抗体库中筛选Fab抗体,其次分析结合能力较好的抗PD-L1的Fab抗体可变区基因中的热点,通过对轻链、重链CDR3区的7处热点随机突变构建噬菌体抗体突变库,从中筛选出亲和力得到提高的抗体。最后在抗体骨架区引入两个二硫键,构建二硫键稳定的抗PD-L1的ds-Diabody,并在毕赤酵母GS115中进行表达。结果：该方法筛选获得了6株特异性抗PD-L1噬菌体Fab抗体,对结合能力较好的其中一株抗体CDR3区的热点进行随机突变,成功构建库容为1.14×10⁸ CFU/mL的噬菌体抗体突变库,并从中筛选出亲和力提高约6倍的噬菌体抗体突变株。对该抗体骨架区进行二硫键引入,成功构建与表达二硫键稳定的ds-Diabody。结论：构建的ds-Diabody比Fab抗体与PD-L1结合亲和力高、稳定性好,为药物开发、肿瘤治疗等研究P...     

天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

目的:构建天然兔源噬菌体单链抗体库。方法:采用RT-PCR法从未免疫的兔子脾脏中克隆得到抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,重叠PCR将VH和VL拼接成scFv片段,将scFv连接到噬菌粒pComb3XSS上,电转入XL1-Blue菌中,得到单链抗体库,并用此抗体库筛选抗肌酸激酶抗体。结果:构建了容量为4×108,基因重组率95%的单链抗体库,DNA指纹图谱显示抗体库多样性良好。以肌酸激酶为抗原,从该库中筛到3株抗肌酸激酶的抗体。结论:分析表明构建的天然兔源单链抗体库质量良好,可用于快速筛选、制备多种单链抗体。     

鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的:构建鼠源E型肉毒毒素(BoNT/E)免疫噬菌体单链抗体库,筛选BoNT/E特异性抗体。方法:从E型肉毒类毒素免疫小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,分别扩增出小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因;通过重叠延伸PCR将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成scFv基因,重组于噬粒pS100中,电转化大肠杆菌TG_1,合并所有克隆成初级库;随机挑取克隆进行核苷酸序列测定,对初级库序列多样性进行分析;在辅助噬菌体M_(13)K_(07)的拯救下,构建成scFv噬菌体抗体库;用纯化的BoNT/E对鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库进行3轮富集筛选,制备单克隆的噬菌体抗体颗粒进行酶联免疫吸附试验,阳性克隆进行核苷酸序列测定。结果:鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库的库容为7.09×10~7,随机挑取的20个克隆序列各不相同,序列正确率为85%,基本覆盖了IgHV、IgKV、IgLV的优势家族;纯化的BoNT/E作为抗原通过3轮筛选,噬菌体抗体富集了66倍,第3轮筛选后随机挑取90个克隆制备噬菌体抗体颗粒,酶联免疫吸附试验分析有88个呈现阳性反应,序列比对得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。结论:构建了库容量达7.09×10~7的鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库,筛选得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .     

抗乙型肝炎病毒表面抗原T7噬菌体抗体库的构建

构建T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体.从抗-HBs阳性患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第1条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接.体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库.以乙型肝炎病毒表面抗原进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性.所建抗体库库容为1.53×107,扩增后初级库滴度为2.42×1010pfu/mL.以乙型肝炎病毒表面抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与HBsAg抗原特异结合的噬菌体抗体,成功构建了抗HBsAg蛋白T7噬菌体抗体库.     

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

采用噬菌体表达展示技术,以从乙型肝炎病毒（HBV）表达抗原（HBsAg）阳性血汪有超速离心纯化的HBsAg为固相抗原,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体（ScFv）克隆并提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌XL1－Blue。经IPTG诱导后,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50％硫酸胺沉淀,经SDS－PAGE电泳表明,XL1－Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28kD。免疫活性检测结果表明,该单链抗体具有较强的抗原结合性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

从免疫及天然噬菌体抗体库中筛选抗rP27Kip1单链抗体的研究

用重组p27Kip1蛋白(rP27Kip1) 免疫小鼠,从免疫和未经免疫的小鼠脾脏抽提mRNA并扩增小鼠H链(H链)及L链(L链)基因,分别组装成单链可变区片段(ScFv)基因,构建噬菌体免疫抗体库及天然抗体库. 文库仅经一轮抗原-抗体亲和筛选后,用TaqⅠ/HinfⅠ酶切分析转化子. 获自免疫抗体库的64个克隆中,有11个克隆的酶切片段相同,而天然抗体库的64个克隆的片段则都彼此不同,但有1个克隆的酶切片段与免疫抗体库的11个克隆酶切片段相同. 将这些酶切图谱相同的重组片段分别克隆入原核表达载体pET28b(+),并在大肠杆菌(E. coli)中表达,表达产物经ELISA分析,证实可特异结合rP27Kip1抗原,一方面说明在抗体筛选过程中辅以酶切图谱分析,可以有效提高筛选效率,另一方面,也说明从噬菌体抗体库筛选特异性抗体是制备单克隆抗体(McAb)的理想途径之一.     

抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法：以RSV F蛋白为靶抗原,通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western及Dot blot分析。结果：经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western及Dot blot分析表明为单链抗体。结论：利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。     

噬菌体抗体库技术研究进展

抗体研究可分多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段。特别是噬菌体抗体库 (ｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙ)技术[1 ]可达到不经免疫制备人源性小型化基因工程抗体。这一技术将抗体基因的克隆与表达融为一体 ,是一种新的基因操作技术 ;同时将识别抗原与再扩增能力结合在一起 ,是一种高效的表达和筛选抗体的新一代技术。1　噬菌体抗体库技术的基本原理[2 ,3 ]噬菌体抗体库技术是将抗体ＶＨ和ＶＬ基因与噬菌体的外壳蛋白Ⅲ (ｃｐⅢ )或Ⅷ (ｃｐⅧ )基因随机重组 ,继而感染大肠杆菌 ,经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Ｆａｂ…     

鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体的制备及分析

利用噬菌体抗体库筛选技术获得抗雄性特异性抗原的噬菌体Fab抗体,首次采用雄鼠脾细胞对鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体库进行3轮亲和富集和2轮雌鼠脾细胞吸附,对筛选后特异性噬菌体Fab抗体进行ELISA分析,重组率鉴定及基因测序分析。结果显示,5次筛选后的15个菌落中有9个能产生抗雄性特异性抗原特异性噬菌体抗体,噬菌体Fab抗体的基因重组率为60%,E5克隆的重链、轻链可变区序列分别属于VH1和VκⅣ基因家族,这为挑选出高亲和力的抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体奠定了实验基础,将推进雄性特异性抗原及其抗体的研究进程,并为性别控制研究开创新途径。