小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)多克隆抗体制备与应用

目的 制备兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)的多克隆抗体。方法 采用PCR点突变LDHC基因,并将该基因构建到pET-28a载体上,形成pET-28a-LDHC重组表达载体、将重组载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),诱导表达获得重组人LDHC4蛋白,将重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价,采用Western blot法检测抗血清的特异性,采用免疫组织化学法检测人三阴性乳腺癌组织中LDHC4的表达。结果 获得了特异性的兔抗人LDHC4多克隆抗体,抗体效价达1∶51 200,该抗体可用于Western blot法和免疫组织化学法。结论 成功制备了特异性兔抗人LDHC4多克隆抗体。     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用北大核心CSCD

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。     

含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化小鼠源性含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)蛋白的C段(1109-1213),制备兔抗ADAMTS2多克隆抗体。方法以重组质粒p GEX-6p-1-ADAMTS2(1109-1213)转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过亲和纯化,并且经质谱鉴定;以表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ADAMTS2的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性。结果在大肠杆菌中表达出目的蛋白ADAMTS2,纯化后经质谱鉴定并免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清。血清效价达到1∶160 000以上,且具有良好的特异性。结论成功制备出效价高、特异性好的兔抗ADAMTS2抗体。     

小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.     

志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。     

抗PIP5KL1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:构建人4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶(phos-Dhatidylinosito1-4-phosphate 5-kinases-like 1,PIP5KL1)质粒并在大肠杆菌中表达,纯化得到相对分子质量(Mr)为42 000的融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备兔抗PIP5KL1多克隆抗体.方法:采用PCR的方法获得编码人PIP5KL1的cDNA序列,将其克隆入pET-32a,构建pET32a-PIP5KL1表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导下表达6×His-融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗人PIP5KL1血清,以Western blot和ELISA方法分析其特异性和效价.结果:PIP5KL1融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,West-em blot结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1:100 000.结论:获得了纯化的PIPSKL1融合蛋白和anti-PIP5KL1多抗血清,为今后对新基因PIP5KL1功能研究打下了基础.     

兔抗人精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B)多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗人精子顶体精子溶菌酶样蛋白1结合蛋白(SAS1B)多克隆抗体。方法构建pET-22b-SAS1B-His质粒,转化E.coli.BL21(DE3)细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导SAS1B重组蛋白表达。用层析纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔制备SAS1B多克隆抗体。ELISA检测SAS1B抗体效价,Western blot和免疫组织化学法鉴定SAS1B抗体特异性。结果在构建pET-22b-SAS1B-His原核表达载体的基础上,在BL21(DE3)细胞成功诱导表达SAS1B重组蛋白。制备的兔抗人SAS1B多克隆抗体效价为1∶51 200。SAS1B多克隆抗体能与SAS1B重组蛋白特异结合且能识别乳腺癌组织中的SAS1B蛋白。结论成功制备具有较好特异性的兔抗人SAS1B多克隆抗体。     

人精子肌动蛋白样蛋白7a蛋白在大肠杆菌系统的表达纯化及多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌系统表达并纯化人精子肌动蛋白样蛋白7a(ACTL7a)的N段(1-70),制备兔抗ACTL7a多克隆抗体.方法 构建重组表达质粒pGEX-6p-1-ACTL7a(1-70),以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌,IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍离子金属螯合树脂和谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B树脂两次亲和纯化和分子筛分离目的蛋白;以表达的ACTL7a(1-70)蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ACTL7a的多克隆抗体.ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性,免疫荧光组织化学技术检测ACTL7a在曲精小管细胞的表达.结果 经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达出目的蛋白ACTL7a(1-70),纯化后免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清.血清效价达到1∶160000以上,且具有良好的特异性.结论 成功构建了ACTL7a基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,经纯化获得高纯度的目的蛋白;制备出兔抗ACTL7a抗体,效价及特异性均良好.     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定

目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin), 制备多克隆抗体, 并进行初步鉴定.方法:RT-PCR获得Amelotin成熟肽片段, 构建pET32a-Amelotin, IPTG诱导表达Amelotin, 纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, ELISA检测抗体滴度.Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔, 得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1:12 800.Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin, 免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用.结论:以纯化的Amelotin为免疫原, 成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelotin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础.     

大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)多克隆抗体的制备及活性鉴定

目的制备大鼠Toll样受体2胞外段(TLR2ex,405T-573Q)的多克隆抗体并鉴定其活性。方法用反转录PCR从大鼠肝细胞中扩增长507个碱基的TLR2部分胞外段,并构建重组表达载体p ET28a-TLR2ex。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达TLR2ex-6×His融合蛋白,该蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。ELISA鉴定抗血清的效价,Western blot法检测抗血清的特异性。结果成功构建了原核表达载体p ET28a-TLR2ex,并成功表达纯化了TLR2ex-6×His融合蛋白,将该蛋白免疫BALB/c小鼠后获得抗血清;Western blot法结果显示该血清可以特异性地检出E3大鼠脾组织TLR2蛋白,ELISA测定该多克隆抗体的效价可以达到1∶76 800。结论成功制备了大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)的多克隆抗体。     

犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用

目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性。结果通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体p ET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶6 400 000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性。结论成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体。     

釉成熟蛋白多肽多克隆抗体的制备和应用

目的制备兔抗鼠釉成熟蛋白(amelotin)的多克隆抗体并进行鉴定和应用。方法对amelotin的蛋白质序列进行分析,选取一段氨基酸序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联免疫新西兰大白兔,制备多肽抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法分析抗体特异性。免疫组织化学技术观察amelotin在小鼠下颌组织的表达情况。结果制备的兔抗amelotin抗体效价为1∶1 000 000,特异性高。免疫组织化学染色结果显示amelotin在3、7 d小鼠的磨牙釉质全层有强表达,并且在7 d小鼠下颌下腺的导管上皮细胞质中也有表达。结论成功制备了效价高、特异性好的兔抗amelotin抗体。     

人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高灵敏度和高特异性的人高致病性H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白抗体并对其效价进行初步评估.方法 构建含有H5N1亚型禽流感病毒NS1序列的pET-28a(+)重组载体的大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达NS1蛋白,并经Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得NS1重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定.以纯化的蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗NS1血清,亲和纯化获得多克隆抗体.应用ELISA和Western Blot检测纯化抗体的效价和特异性.结果 NS1融合蛋白得到高表达,且纯度＞90％,用该融合蛋白免疫新西兰大白兔后得到的抗NS1多克隆抗体,效价达1∶80 000,并特异性识别H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白.结论 获得了NS1多克隆抗体,具有较好的效价和特异性.     

热休克蛋白16.3多克隆抗体的制备

目的大肠杆菌表达Hsp16.3,制备其多克隆抗体。方法设计引物,从H37Rv基因组中扩增出目的片段Hsp16.3,pET28a-Hsp16.3质粒的构建、克隆和表达。对His-Hsp16.3进行诱导、表达和纯化。用纯化好的蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,用ELISA检测抗血清中多抗的效价,用Western blot法检测多克隆抗体的生物活性。结果重组质粒pET28aHsp16.3在E.coli BL21(DE3)中成功表达,SDS-PAGE结果显示在His-Hsp16.3的相对分子质量(Mr)约为20 000。制备的多克隆抗体效价为1∶800,且特异性较好。结论成功的克隆、表达、纯化出His-Hsp16.3,并且成功制备了抗Hsp16.3多克隆抗体。     

小鼠SAP基因的克隆、表达及多抗制备

目的 制备小鼠SAP多克隆抗体,为进一步研究其功能和探讨其与炎症,肿瘤等疾病的相关性提供素材。方法 PCR扩增小鼠SAP基因编码区的DNA片断,将其重组入原核表达质粒pET30a(+),转化入大肠杆菌BL21中,异丙基β-D硫代办乳糖苷（IPTG）诱导产生His/mSAP融合蛋白,SDS-PAGE分析结果表明,蛋白主要以包涵体形式存在。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、Western blot来检测抗血清效价及特异性。结果 成功的构建了pET30a(+)/mSAP重组质粒,表达融合蛋白,免疫兔子所获的mSAP多克隆抗体。结论 mSAP多克隆抗体特异性强,效价高。     

11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。