丙型肝炎病毒人源单克隆抗体的初步筛选

目的构建天然人源噬菌体抗体库,初步筛选人源抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)多肽抗原的单克隆重组噬菌体抗体。方法以健康成人外周血淋巴细胞cDNA为模板,采用PCR技术扩增轻(VL)、重链(VH)可变区基因;重叠PCR法拼接生成单链抗体可变区基因片段(single chain fragment variable,scFv),并克隆至噬菌体载体p CANTAB5e,得到初级抗体库;使用HCV多肽混合抗原,经3轮淘筛富集噬菌体抗体;Phage ELISA法初步筛选HCV重组噬菌体抗体。结果成功构建了天然人源噬菌体抗体库。scFv(VH-κ)库的库容为6.0×10~7 PFU/mL,scFv(VH-λ)库的库容为4.28×10~9 PFU/m L;经初步淘筛,成功获得HCV三级抗体库;Phage ELISA得到了3株候选重组噬菌体抗体。结论初步得到HCV多肽抗原重组噬菌体抗体,为今后进一步筛选高亲和力噬菌体抗体和可溶抗体奠定了基础。     

人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选。方法以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定。以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性。结果获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性。结论已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法。     

从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体

目的　应用纯化的狂犬病毒抗原从半合成噬菌体抗体库中筛选针对狂犬病毒的人单链抗体(ScFv)。方法　用固相化的狂犬病毒抗原对半合成抗体库进行 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,从第 3轮洗脱下来的克隆中获得一株有可溶性表达且特异性结合狂犬病毒抗原的ScFv ,并进行基因序列测定。结果　所获氨基酸序列经blast数据库搜索 ,与一种抗狂犬病毒免疫球蛋白的氨基酸序列同源性最高 ( 82 % )。经检索kabat数据库 ,发现其轻、重链可变区分别属于VkⅠ型、VHⅢ型。结论　从噬菌体抗体库可以方便快捷地分离到针对狂犬病毒的单链抗体 ,对狂犬病毒的预防具有重要意义     

大容量人源核糖体展示单链抗体文库的构建

目的构建大容量、多样性的人源核糖体展示(Ribosome display,RD)单链抗体(Singe chain Fv segment,scFv)库。方法收集20名健康献血者的新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA;设计兼并引物,利用RT-PCR分别扩增人抗体的VH-linker、Vκ、Vλ及Cκ基因;采用重叠PCR(SOE-PCR)技术,构建VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ单链抗体库;将VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ等量混合后,与pMD19-T载体连接,并转化感受态E.coli DH5α,对所构建的scFv库进行菌落PCR和测序分析。结果构建的核糖体展示单链抗体库重组率较高,转化产物经菌落PCR鉴定,均可见约1 000 bp的scFv基因片段,库容量为2.06×1013。经分析该抗体库单链抗体序列均完整,内部无终止密码子,可变区序列无一重复,多样性良好,均具有完整的体外核糖体展示框架。结论已成功构建了大容量、多样性好的人源核糖体展示单链抗体库,为进一步筛选高特异性、高亲和力的人源抗体奠定了基础。     

从大容量噬菌体抗体库获取人源性抗角蛋白抗体ScFv及Diabody的构建

目的从大容量噬菌体抗体库筛选人源性抗角蛋白抗体,并构建双体抗体(Diabody)。方法以固相化的角蛋白对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经3～4轮筛选后,挑取克隆,ELISA法鉴定其特异性,并对部分抗角蛋白阳性抗体克隆基因进行DNA序列分析。选取活性好的克隆基因进行改造,构建Diabody表达载体。结果在抗体库的筛选过程中可见明显的富集现象,获得了29株可与角蛋白特异性结合的人源单链抗体,选取4个克隆基因进行序列分析,结果表明,4个克隆的轻链基因均属于λ轻链第1亚群,1号和8号克隆的重链基因属于人IgG第2亚群,6号和29号克隆分别属于第1和第3亚群。从表达抗角蛋白抗体的集落中挑选一个进行基因改造,构建的Diabody表达载体所表达的Diabody活性较高。结论利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗角蛋白抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为开发银屑病治疗性抗体奠定了基础。     

噬菌体单链抗体碱性磷酸酶细胞ELISA检测方法的建立

目的建立噬菌体单链抗体碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)细胞ELISA检测方法,以期排除外周血中白细胞的干扰,将筛选到的噬菌体抗体用于临床样本的检测。方法从大容量噬菌体抗体库中筛选与食管癌细胞结合的噬菌体单链抗体,制备食管癌细胞KYSE-170和EC109鉴定板及白细胞鉴定板,采用ALP细胞ELISA法分析筛选到的噬菌体抗体与两种食管癌细胞及白细胞的结合活性,同时与辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)细胞ELISA法进行比较,以抗卵清蛋白(ovalbumin,OA)为阴性对照。结果经ALP细胞ELISA法检测,筛选到的噬菌体抗体1、2、3均可与KYSE-170和EC109细胞结合,A405值在检测范围内;3个噬菌体抗体与不同食管癌细胞系的结合活性差异有统计学意义(P<0.001);抗OA抗体与两种食管癌细胞的结合活性明显低于3个噬菌体抗体,且差异有统计学意义(P<0.001);3个噬菌体抗体与白细胞结合的A405值在检测范围内,与食管癌细胞系的结合活性相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ALP细胞ELISA法可鉴定噬菌体单链抗体,并可排除白细胞的干扰,有望应用于临床样本的检测。     

人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选

目的从自建的大容量非免疫Fab噬菌体抗体库中筛选具有抗甲型肝炎病毒(HAV)抗原活性的噬菌体抗体,并进行鉴定。方法采用纯化的甲型肝炎病毒作为包被抗原,对自建的容量为1.26×1011pfu/ml的Fab噬菌体抗体库进行筛选和富集,分别对原始库和筛选后的抗体库进行Phage-ELISA和活性检测,经酶切鉴定和DNA测序分析后进行诱导表达。结果经2轮筛选,抗-HAV抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,ELISA检测证实其具有良好的抗甲肝病毒抗原的特异性,抑制率为38.61%。酶切鉴定表明抗体库重组较稳定。SDS-PAGE检测显示Fab抗体蛋白在E.coliDH5α中得到了表达。结论从自建的非免疫Fab噬菌体抗体库中成功获得了抗甲肝病毒噬菌体抗体,所构建的非免疫抗体库可用于人源性抗体的筛选。     

全人源单链抗体库噬菌体展示技术的建立

目的建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(V_H)和轻链可变区片段(V_L),然后以V_H和V_L为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfiⅠ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养,上清液经PEG-NaCl沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定。结果成功构建了库容为2. 6×10~9的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体。结论成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选。     

抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选

目的构建多样性良好的抗白念珠菌人源性单链抗体库,筛选抗白念珠菌特异性的噬菌体抗体。方法从20份人外周血淋巴细胞(包括正常成年人5份、新生儿5份和白念珠菌感染恢复期患者10份)中提取总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,以重叠延伸PCR法将VH和VL拼接成scFv基因,克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建人源抗白念珠菌天然噬菌体抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果构建的人源性抗白念珠菌天然噬菌体抗体库库容为2.8×109,多样性良好。共筛选出18个阳性克隆。结论已成功构建了1个多样性良好的抗白念珠菌人源性噬菌体抗体库,为筛选有效治疗白念珠菌和耐药性白念珠菌感染的药物提供了条件。     

鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选

目的构建鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体。方法用EHEC O157∶H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠,取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(к和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3X中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07进行超感染,构建抗EHEC O157∶H7 Stx2的Fab噬菌体抗体库。以纯化的Stx2为抗原进行筛选,获得抗EHECO157∶H7Stx2的特异性Fab抗体,Western blot法检测噬菌体抗体与毒素抗原的结合活性,并对所得阳性克隆进行基因序列分析。结果构建了一个库容为1.56×107的Fab抗体库,筛选出3株特异性较强的阳性克隆,其中2个可与Stx2A1亚单位抗原反应,1个可与Stx2B亚单位抗原反应。基因序列分析显示,轻、重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白可变区氨基酸序列同源性分别为98.5%和99.6%。结论已成功构建了鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,为进一步制备抗EHECO157∶H7Stx2的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选

目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。     

仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库的构建及初步筛选

目的构建仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,并进行初步筛选。方法用仙台病毒Tianjin株免疫小鼠,制备脾细胞悬液,提取小鼠脾细胞总RNA,RT-PCR扩增鼠抗体轻链(κ链)和重链Fd基因,将轻链基因和噬菌粒p3MH经SacⅠ和XbaⅠ双酶切后纯化回收,经T4 DNA连接酶连接,电转化E.coli XL1-Blue,构建轻链库;将重链Fd段基因和轻链库p3MH-κ经SpeⅠ和XhoⅠ双酶切后,纯化回收并连接,电转化E.coli XL1-Blue,获得噬菌体抗体库,计算重组率和抗体库滴度。以仙台病毒Tianjin株重组蛋白HN2为抗原进行初步筛选,制备噬菌体抗体,并进行测序。结果构建的免疫噬菌体抗体库库容为1.18×107,重组率为90%,制备的噬菌体抗体滴度为1011pfu/ml;经初步筛选,噬菌体富集了约63.6倍,获得2株与重组蛋白HN2有结合活性的阳性克隆,经NCBI BLAST进行同源性分析,显示为鼠源性抗体,经IMGT分析,显示轻链基因与Vk9亚群基因的同源性为94.87%,重链基因与VH7亚群基因的同源性为97.85%。结论成功构建了仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,为该病毒株的诊断、疾病治疗及致病机制等研究奠定了基础。     

抗CD_3单链抗体基因克隆与表达

采用重叠延伸拼接法 (SOE)连接抗CD3 抗体的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VK)基因 ,构建单链抗体基因 (ScFv)并将其克隆于含Tac启动子质粒中 ,用斑点杂交法筛选出重组子 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )并诱导其表达     

采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库

目的　构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法　从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度 (1:10 2 4 )的人全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经RT PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区 ,再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区 (Cκ)和重链恒定区 (CH1) ,将轻链可变区和轻链恒定区 (Cκ)及重链可变区和重链恒定区 (CH1)进行第 1次基因拼接 ,分别形成κ轻链和Fd重链 ,再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第 2次基因拼接 ,形成完整的Fab基因 ,与pComb3H SS噬菌体质粒连接后 ,电穿孔转化大肠杆菌XL1 Blue。结果　通过多次电穿孔转化 ,获得总容量为 4× 10 5库容的噬菌体抗体库。结论　构建的Fab抗体库可用于筛选特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子     

免疫抗体文库的构建及亚nM高亲和力人源抗体的筛选

目的构建免疫抗体文库,并筛选亚nM高亲和力人源抗体。方法采用破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)免疫的高效价人B淋巴细胞,经PCR扩增可变区基因,构建免疫抗体文库,并筛选高亲和力人源抗体。将获得的抗体基因片段转换成全分子,进行真核表达和纯化,并与人抗TT多克隆抗体进行比较分析。结果构建的人破伤风免疫噬菌体抗体库库容为4.5×106,多样性符合引物设计要求,经筛选获得相对亲和力为10-10M的高亲和力人源抗体,其体内中和活性高于人多克隆抗体。结论根据抗体基因使用频率设计引物构建小容量免疫抗体文库,可获得亚nM的高亲和力人源抗体,该策略可用于抗感染性疾病人源抗体的开发。