急性传染性法氏囊病的电镜诊断

从自然暴发传染性法氏囊病雏鸡的法氏囊和盲肠扁桃体取材制超薄切片。电镜检查，确诊病原、观察病毒的形态结构及其与宿主的相互作用。电镜下在法氏囊及盲肠扁桃体的巨噬细胞胞浆内发现病毒包涵体，包涵体内含有大小不等的圆形或椭圆形的病毒晶体，其内病毒颗粒呈圆形及六角形，大小及形态较一致，排列规整，测其直径为50～64nm，平均58nm。多数病毒颗粒核心电子致密，外被单层衣壳，少数为空衣壳，均无囊膜，完全符合传染性法氏囊病毒的形态特征。文中对该病毒在淋巴细胞内复制的问题进行了讨论。     

自然感染鼠痘的小鼠肝脾内病毒超微结构的观察

应用自然感染鼠痘存档5年蜡块转制超薄切片，在电镜下观察发现鼠痘病毒的复制部位是在肝脾细胞浆的基质区和包涵体的周围。此部位有大量不同发育阶段的病毒颗粒。未成熟病毒颗粒可分为球状颗粒和含有拟核的球状颗粒。成熟病毒颗粒的典型形态呈年椭圆形，外被双层囊膜，中心含有哑铃形核心，核心两侧各有一个测体。本实验结果证实应用存档蜡块转制超薄切片，可成功地应用于鼠痘感染及追溯性鼠痘病原和传染源的电镜诊断。并在电镜下证实光镜下A、B型包涵体及免疫酶组化病毒抗原的阳性部位与鼠痘病毒生物合成和装配的部位是一致的。     

胶体化学法制备氧化铁超微粉体

对氧化铁超微粉体的胶体化学法最佳制备工艺条件进行了探讨,其中溶液温度和ＰＨ值对水合氧化铁溶胶的形成和稳定性具有较大影响。研究了氧化铁超微粉体的表面性质,ＳＥＭ分析和孔径分布测定表明,本方法的氧化铁超微粉体粒子外观呈球形,其粒径以４～６ｎｍ为主。     

SPF金黄仓鼠原代肾细胞的安全性

目的验证SPF金黄仓鼠原代肾细胞的安全性。方法采用ELISA法检测10种鼠源病毒血清抗体。通过细胞直接观察、细胞培养试验和血吸附病毒试验检测外源因子。并用直接XC蚀斑法、S+L检验法、电镜观察和双模板法以及联合培养与F-PERT法检测逆转录病毒及逆转录酶活性。结果10种鼠源病毒抗体为阴性,未检出外源因子、逆转录病毒和逆转录酶。结论SPF金黄仓鼠原代肾细胞作为乙型脑炎减毒活疫苗的生物原材料安全可靠。     

中国流行株HIV-1Gag蛋白在重组鸡痘病毒的表达及鉴定

目的 以鸡痘病毒为载体,表达ＨＩＶ－１　Ｇａｇ蛋白,进而研制ＡＩＤＳ疫苗。方法 以鸡痘病毒２８２Ｅ４株 非必需区ＴＫ基因为侧翼,插入ＶＶ突变型Ｐ７．５串联启动子和牛痘病毒Ａ包涵体晚期启动子与２０个串联的突变型 早期痘苗病毒Ｐ７．５启动子组成复合启动子及ＬａｃＺ报告基因构建重组表达质粒ｐＵＴＡＬ。在ＡＴ１－Ｐ７．５复合启动子 下游,插入编码中国流行株 ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因（Ｂ亚型）,构建了重组表达质粒ｐＵＴＡＬ－Ｇａｇ。重组质粒Ｇａｇ与ＦＰＶ共 转染ＣＥＦ细胞,进行同源重组。通过ＢＵｄＲ加压筛选,Ｘ－ｇａｌ染色,获得重组鸡痘病毒ｖＵＴＡＬＧ,用于感染ＢＨＫ细胞 并免疫小鼠。结果　经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测,重组病毒表达了Ｇａｇ蛋白相对分子质量分别为５５０００、４８０００、２４０００和 １７０００,为Ｇａｇ蛋白的Ｐ５５、Ｐ４８、Ｐ２４和Ｐ１７蛋白。重组病毒免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。结论　所重组的病毒 成功地表达了目的蛋白并进行了正确加工。     

Gaucher病的临床病理分析

目的探讨Gaucher病的临床病理特征及鉴别诊断。方法应用HE、特殊染色、免疫组化染色,观察2例Gaucher病的组织学形态及免疫组化特征,并复习文献。结果 2例中女性1例,男性1例。年龄分别为4岁和8岁。均以肝脾肿大入院,分别行全脾加部分肝组织切除及全脾切除。光镜下Gaucher细胞体积大,胞浆丰富,淡红色毛玻璃样。高倍镜下胞浆内可见细丝状平行纹理,核小,圆形椭圆形。核位于细胞一侧或中央,瘤细胞呈巢状或腺泡状排列。PAS染色,Gaucher细胞均阳性。免疫组化:Gaucher细胞CD68(+),LYS胞浆阳性。α1-抗胰蛋白酶(-),Mac38(-)。结论 Gaucher病是一种少见的常染色体隐性遗传脂类代谢异常的疾病,临床医生很容易误诊,应注意与引起肝脾肿大的其他疾病鉴别。     

诺如病毒衣壳蛋白在293T细胞中的表达及纯化

目的在293T细胞中表达诺如病毒衣壳蛋白,并进行纯化。方法将合成的人诺如病毒GII.4悉尼大流行株VP1基因(全长1 623 bp)插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒,测序验证无误后,通过磷酸钙共沉淀法将质粒转染至293T细胞中,收获转染细胞上清,进行Western blot鉴定。转染3~5 d后,收获细胞上清,经氯化铯平衡密度梯度离心纯化衣壳蛋白,收集各组分,离心沉淀病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),PBS重悬后,SDS-PAGE分析目的蛋白的纯度;电镜观察VLPs;BCA法测定蛋白含量。结果 Western blot分析显示,重组表达质粒转染的293T细胞上清可见特异的蛋白条带。收获的细胞培养上清经氯化铯平衡密度梯度离心后,可见3个明显条带;10%SDS-PAGE分析显示,衣壳蛋白主要位于第3个条带,纯度达95%以上;目的蛋白有2个条带,相对分子质量分别为59 000和56 000;收集的3个组分经电镜观察可见,表达的诺如病毒衣壳蛋白主要位于第3个条带,且组装成了VLPs,颗粒大小约为38 nm;每升培养基可获得约500μg VLPs。结论成功在293T细胞中表达了诺如病毒衣壳蛋白,该衣壳蛋白成功组装成了VLPs。本实验建立了一种小规模制备诺如病毒VLPs的新方法。     

甲型肝炎病毒在FRhk-4细胞培养繁殖中的特性

本文对 HAV-FH 株病毒在 FRhk-4细胞繁殖的特性进行了观察,该株 HAV 感染 FRhk-4细胞后26至28天达繁殖高峰,病毒不自发释放于细胞外;不同日龄细胞接种同代同量病毒,其繁殖高峰随日龄不同而有所不同;同龄细胞接种不同量病毒则无明显差别。用免疫酶玻片法、免疫荧光染色法观察病毒增殖情况,在种毒后24小时胞浆内就有 HAV 存在,随培养时间延长查出感染病毒的细胞数增多,堆积在核周围表面的特异性着色的病毒颗粒增加。脱落细胞裂解后的提取液中也有相当数量的病毒。接种 HAV 后的 FRhk-4细胞提取液,通过中速、高速离心所获病毒液,用磷钨酸负染在电子显微镜下观察见有大量规则的 HAV 颗粒,其直径为27μmm。文中附有病毒繁殖动态、不同日龄 FRhk-4细胞对病毒繁殖的影响、免疫荧光染色及电镜照片。     

地鼠肾原代细胞外源病毒调查

清洁级、普通级2周龄地鼠，按卫生部颁布的无特异病原体（SPF）级的标准李行病毒抗体检测均为阴性。但8批用清洁级地鼠制备的肾原代细胞中均未发现有血吸附现象，而在普通级，血吸附阳性率高达86％（18／21）。超离浓缩后血凝效价达1：4～1：64；负染后用电镜可观察到副流感样病毒颗粒。经血清学检测，该外源病毒与仙台和小鼠肺炎病毒抗原相关，但按常规方法不易在鸡胚和同种地鼠肾细胞上传代。     

反义c-myc基因质粒对鼠脑胶质瘤细胞C6生长的影响

目的探讨反义ｃ－ｍｙｃ基因质粒对鼠脑胶质瘤细胞Ｃ６增殖及凋亡的作用。方法将可在真核细 胞表达大鼠反义 ｃ－ｍｙｃ基因的质粒 ｐＣＥＰ４ＡＳＣＭＲ以脂质体 ＦｕＧＥＮＥ６为介导,转染到大鼠脑恶性胶质瘤细胞 Ｃ６株 中,经ＭＴＴ检测,软琼脂集落生长,吖啶橙染色,琼脂糖电泳等方法分析实验结果。结果反义ｃ－ｍｙｃ基因质粒 ＤＮＡ具有抑制瘤细胞增殖的作用,并能引起瘤细胞凋亡;脂质体ＦｕＧＥＮＥ６有助于提高质粒ＤＮＡ的转染效率。结论 反义ｃ－ｍｙｃ基因质粒可抑制ｃ－ｍｙｃ基因的过度表达,促使肿瘤细胞凋亡,达到治疗脑神经胶质细胞瘤的目的。     

流行性出血热病毒在地鼠肾细胞中增殖动态的形态学及形态发生学研究

用普通电镜及免疫电镜对流行性出血热病毒(EHFV)不同毒株感染地鼠肾细胞(GHKC)的形态及形态发生学特点、其特征性包含体的形态及感染细胞超微结构的改变,以及感染后不同天数的病毒增殖动态进行了观察。     

甲型肝炎病毒与水痘病毒感染2BS细胞的超微结构变化

目的观察甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)、水痘带状孢疹病毒(Varicella zoster virus,VZV)分别感染与共同感染二倍体细胞2BS株时细胞超微结构的变化。方法电镜观察HAV单独感染21、23、25 d,VZV单独感染1、3、5 d及HAV感染21 d后再以VZV感染1、3、5、7 d的2BS细胞的超微结构。结果与正常对照2BS细胞相比,单独感染HAV的2BS细胞超微结构无明显变化;单独感染VZV的2BS细胞的超微结构主要出现核膜破坏;HAV与VZV共同感染的2BS细胞核内出现VZV包涵体,核膜缺失,胞浆中可见HAV与VZV形态,且细胞粗面内质网和滑面内质网膨胀,内质网小池内有致密颗粒。结论HAV与VZV共同感染的2BS细胞的超微结构与两种病毒单独感染的细胞的超微结构存在不同的变化规律和形态特征,先感染HAV后感染VZV的2BS细胞比单独感染VZV的2BS细胞受到的破坏程度轻。     

新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响

目的分析新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响。方法在6孔细胞培养板上将4种重组表达质粒以pCI-M+pCI-NP+pCI-F和pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,光镜观察细胞融合现象。在25cm2细胞培养瓶中,将4种重组表达质粒以上述两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,收集细胞上清,离心后,电镜观察有无病毒样颗粒。结果以pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN组合共转染BHK-21细胞,可以观察到明显的细胞融合现象,而以pCI-M+pCI-NP+pCI-F组合共转染的BHK-21细胞则未出现细胞融合现象。两种组合共转染均形成了新城疫病毒样颗粒,包含HN蛋白基因的4种重组质粒组合共转染形成的病毒样粒子更接近于真实的新城疫病毒粒子。结论HN蛋白基因具有促进细胞融合的功能,新城疫病毒样颗粒的成功表达为新城疫病毒致病机理和新型疫苗的研究奠定了基础。     

氧化锌纳米粒子的制备

以ＺｎＳＯ_４· ７Ｈ_２ Ｏ为原料,添加 ＮａＯＨ溶液和 ＮＨ_４ ＨＣＯ_３粉末,制备出晶粒细小的碱式碳酸盐前驱体。８０℃干燥后,分别在３００、４００、５００℃焙烧１ｈ,制备出氧化锌ＺｎＯ纳米粒子。经ＸＲＤ和ＴＥＭ检测,粒径为１０、１４、２０ｎｍ。由于采用了对盐渍化的凝胶状前驱体先焙烧,然后用蒸馏水浸洗除去硫酸钠的方法,氧化锌纳米粒子粒径细小而均匀。     

人二倍体细胞对不同病毒感染过程的生物学效应比较分析

目的分析人二倍体细胞对不同病毒感染的生物学反应差异性及相关分子生物学机制。方法用人类肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和人单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染人二倍体细胞,光镜和电镜下观察感染细胞形态学特征;比较两种病毒在人二倍体细胞上的增殖动力学及两种病毒感染后细胞酶谱的变化;采用基因芯片检测两种病毒感染后人二倍体细胞基因反应的差异。结果感染细胞的光镜或电镜的超微结构观察均表现出许多相同的特点,包括细胞变圆、肿胀、折光性增强,以及细胞细微结构的受损,大多数细胞器的破坏等。两种病毒在人二倍体细胞上具有不同滴度峰值的增殖动力学过程;对细胞超氧化物歧化酶的动力学改变趋势有不同影响,但对乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶动力学变化趋势无明显影响;两种病毒感染引起人二倍体细胞出现不同的基因反应,其中与信号转导及与天然免疫反应有关的mRNA转录效率具有一定的差异。结论人二倍体细胞对EV71、HSV-1感染过程表现不同的生物学效应。     

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒核蛋白合成基因的表达及应用

目的 用合成基因表达产物取代淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（ＬＣＭＶ）或其他方法重组蛋白抗原, 用于ＬＣＭＶ感染的诊断。方法 采用Ｐｒｏｓｉｓ软Ｓ件对ＬＣＭＶ核蛋白（Ｎｐ）全长氨基酸序列进行亲疏水性分析,合成ＬＣ－ ＭＶ ｓＲＮＡ第１８１６－２１７８位核苷酸序列编码的Ｎｐ第３８０～５００位氨基酸基因,克隆在Ｈｉｓ－ｔａｇ ｐＥＴ－２８ａ融合表达,表 达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,建立ＥＬＩＳＡ检测试剂。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,表达量 达２０％以上。表达产物经Ｎｉ－ＮＴＡ－Ａｇａｒｏｓｅ纯化后纯度达到９０％以上。经检测９３份人血清．有６份病毒抗体阳 性,阳性率为６．５％（６／９３）,与全病毒抗原检测结果７．５％（７／９３）相近。结论 用合成基因表达产物取代ＬＣＭＶ抗原 检测病毒抗体,不仅可以消除病毒传播可能,而且特异性强。为ＬＣＭＶ感染诊断及生物材料质量控制提供有效方 法。     

小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体的分离及鉴定

目的 分离纯化小鼠原代腹腔巨噬细胞分泌的外泌体并进行鉴定。方法 分别经5只雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤,灌洗获得小鼠原代腹腔巨噬细胞后,用流式细胞术分析纯度。采用ExoQuick TC外泌体试剂盒提取小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体,BCA试剂盒测定外泌体蛋白含量,透射电镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径及分布,Western blot法检测外泌体标志物(CD9、CD63和TSG101)的表达。结果 每只小鼠可获得约5×10⁶个纯度为(99.17±0.65)%的腹腔巨噬细胞。5 mL小鼠原代腹腔巨噬细胞培养上清液中可提取869μg外泌体蛋白。小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体在电镜下呈折光性较强的典型茶托样囊泡,高表达外泌体特异性标志物TSG101、CD63和CD9,粒径分布集中在100～200 nm,平均粒径为175.2 nm。结论 腹腔注射巯基乙酸盐肉汤可提高小鼠原代腹腔巨噬细胞得率,ExoQuick TC外泌体试剂盒能够提取足量且纯度较高的小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体。     

荚膜组织胞浆菌和马尔尼菲青霉菌鉴定分析

目的鉴定引起组织胞浆菌病和马尔尼菲青霉菌病的对应病原菌荚膜组织胞浆菌(HC)和马尔尼菲青霉菌(P.mar)。方法分别把骨髓直接涂片瑞氏染色(Wright's stain)镜检且接种于双相培养基35℃孵育,待生长后涂片检查并转种血琼脂和沙保弱培养基上,分别于25℃及35℃孵育,观察生长情况及菌落形态,进行涂片显微镜检。对二者作认真细致的比较。结果HC在骨髓直接涂片瑞氏染色中均呈大小一致的圆形或卵圆形孢子,胞浆多呈半月形并集中于孢子一端,孢子边缘有染色过程中皱缩所致的未染色区域(似荚膜)。P.mar在涂片中可见具有诊断意义的有横隔腊肠形孢子细胞或椭圆孢子细胞;HC在沙保弱培养基(SDAI)25℃条件下呈典型的梨形厚壁孢子和齿轮状大分生孢子。P.mar25℃条件下则呈现具特征性水溶性玫瑰红色素及镜下典型的的双轮生青霉帚状枝。结论HC和P.ma在骨髓涂片镜检的典型形态上有区别,真菌培养是确定并能严格区分此二者的可靠方法。     

干扰素诱导的MxA蛋白及其抗丙型肝炎病毒感染作用的研究进展

干扰素α(Interferon α,IFNα)是目前公认的可有效抗丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的药物,其主要通过诱导细胞产生抗病毒蛋白而发挥作用。抗黏病毒蛋白A(Mixovirus resistance protein A,MxA)是由I型IFN诱导产生的相对分子质量为78000的抗病毒蛋白,主要分布于细胞质中,具有识别HCV核糖核蛋白复合物(Virus ribonucleoprotein complexes,vRNPs)的功能,通过MxA的GTP酶活性水解HCV核衣壳,使病毒核酸释放并被胞浆中的核酸内切酶降解。本文主要对IFN的分类、MxA的结构和作用机制及近年来MxA抗HCV感染作用的研究进展作一综述。     

尖锐湿疣患者角质形成细胞的培养及其生物学特性鉴定

目的 对尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)患者皮损处角质形成细胞进行培养及鉴定,测定β-catenin m RNA表达情况,分析细胞周期的变化。方法 采用两步消化法对皮损细胞进行消化,获得原代角质形成细胞后,进行体外无血清培养基培养。镜下观察细胞形态,并进行免疫组化染色鉴定;绘制细胞生长曲线;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞周期。结果 镜下可见细胞为多角形或不规则形,呈铺路石状,细胞生长旺盛,轮廓清晰,折光性好,胞浆均被染成红色,为角蛋白阳性,于第3天开始进入对数生长期,第7、8天进入平台期。获得的角质形成细胞可稳定增殖,在CA的发病过程中,β-catenin m RNA的表达异常,细胞周期发生改变。结论 CA的发病过程中β-catenin m RNA的表达异常及细胞周期的改变可为CA的临床治疗提供了理论依据。