传统发酵豆制品中3种致病菌的三重荧光PCR快速检测方法的建立

为了建立传统发酵豆制品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光PCR快速检测方法。以单增李斯特菌hly A基因、蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因设计引物与TaqMan探针,通过优化PCR反应体系,建立了可同时检测单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光定量PCR体系,并进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法灵敏度高,特异性强,重复性好。对26株非目标菌进行检测,结果均为阴性,而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%。单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌敏感性试验结果表明,这三种细菌的最低检测浓度分别为3×103cfu/mL、2×104cfu/mL、2×104cfu/mL。应用该方法可在8h内完成对样品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的同步检测。     

多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

食品中单核细胞增生单核细胞增生李斯特菌的重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

目的 建立食品中单核细胞增生李斯特菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测体系。方法 针对单核细胞增生李斯特菌的特异性基因hlyA,筛选出一组特异性强且高效的引物,建立单核细胞增生李斯特菌的RPA检测体系,并进行特异性、灵敏度检测。结果 建立的RPA方法在37 ℃恒温反应仅需30 min,能够特异地检测单核细胞增生李斯特菌,最低模板浓度可低至0.5 ng/μL。人工染菌试验显示,该RPA体系可以有效扩增出每2.5 g样品中人工染菌10⁴ CFU样品中的单核细胞增生李斯特菌。结论 RPA等温扩增方法特异较强、灵敏度较高,具有操作简便、不需要昂贵仪器、常温进行扩增反应等优点,适用于现场检测以及在基层实验室推广应用。     

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

摘要：目的 建立多重荧光定量聚合酶链反应法（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌的方法。方法 根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果 该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为101、102、102拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE（Salmonella、Listeria monocytogenes and Escherichia coli 3种菌株的共增菌培养基）培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×102 CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×102 CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×102 CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论 所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。     

食品中单核增生性李斯特菌的PCR快速检测研究

为提高食品中单增李斯特菌的检测水平,针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因hlyA、plcB、prfA、iap,设计并筛选出7对引物组成多重-巢式PCR联合检测体系,并结合高灵敏性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,对单增李斯特菌进行快速检测,多重PCR的灵敏度达到1×102CFU ml,巢式PCR的灵敏度达到1×10CFU ml。结果表明该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,而且有效缩短了检验周期,从传统的7～14d缩短到1～2d。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的建立

目的:为食品、卫生行业提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的单增李斯特菌(Listeria Monocyto-genes)与志贺氏菌(Shigella)多重PCR检测方法.方法:根据单增李斯特茵转录调节子基因prfA、志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因ipaH筛选出引物;优化多重PCR的引物浓度、退火温度及Mg2+等条件,分析单-PCR及多重PCR的特异性、灵敏度;结合24 h增茵培养.确定多重PCR检测人工污染脱脂灭茵乳的检出限.结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即单增李斯特茵(274bp)和志贺氏茵(421bp).该方法的灵敏度:78 pg单增李斯特茵基因组DNA、7.5pg志贺氏茼基因组DNA.多重PCR检测人工污染脱脂灭菌乳,单增李斯特茵与志贺氏茵的灵敏度分别为2cfu/25mL和1.6cfu/25mL.结论:该方法在食品、卫生行业具有很好的应用和开发前景.     

2012-2014年安康市食品风险监测概况

调查分析安康市食品污染状况,预防食物中毒暴发流行。按照《全国食源性疾病监测工作手册》的要求采样、检测、保存菌株、网络报告。共计监测672份样品,检出致病菌50株,总检出率7.44%。检出沙门、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌O157∶H7,检出率分别为0.17%、3.21%、2.87%、6.76%、0.83%;阪崎肠杆菌、致泻大肠杆菌、大肠杆菌O104∶H4、志贺氏菌均未检出。安康市食品致病菌污染状况复杂,单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌检出率较高,尤其应注意单增李斯特菌引起的食物中毒。     

多重PCR同时检测食品中4 种细菌与常见霉菌

建立一种同时检测食品中金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7以及霉菌的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）、沙门氏菌的侵袭正调节蛋白基因（hilA）、大肠杆菌O157:H7鞭毛基因（flic）、单核细胞增生李斯特氏菌的毒力调控蛋白基因（prfA）及霉菌18S?rRNA基因V5区分别设计5?对特异性引物,并对PCR扩增反应体系和扩增条件进行优化,确定获得特异性良好的PCR扩增产物。而后在37?℃对人工污染致病菌的香肠、面包和豆腐进行增菌培养,5?种致病微生物在20?h内的检出限均可达到100?CFU/25?g。本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中4?种细菌与常见霉菌的同时检测,相较于传统检测方法,具有快速、简便、特异性高的优点。     

多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌

目的 建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR, multiplex qPCR)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法 针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因, 设计4对引物和探针, 优化反应体系, 建立稳定的多重qPCR反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性, 并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果 各对引物和探针对目标菌有较强的特异性, 对其他非目标菌进行检测均未检出, 人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为102 CFU/g, 沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为103 CFU/g, 金黄色葡萄球菌的检出限为104 CFU/g。结论 本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qPCR高效检测。     

双正交优化多重PCR检测食源性致病菌的研究

为了建立快速检测食源性致病菌的多重PCR检测方法,根据沙门氏菌fimY基因、单增李斯特氏菌hlyA基因和小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因设计3对特异性引物,利用双正交法分别对多重PCR反应体系中的3对引物比进行L9(33)正交优化和Taq酶、dNTPs、镁离子、混合引物的添加量进行L16(44)正交优化,并对Buffer的反应浓度进行优化。结果扩增出了3条特异性目的条带,建立的多重PCR方法具有很好的特异性。人工污染食品,9h富集培养增菌后的检出限可达100cfu/g。因此,该检测方法具有较强的实际应用价值,为检测多种食源性致病菌提供了有效的方法参考。     

恒温隔绝式PCR快速检测蜡样芽孢杆菌方法的建立及应用

该研究以编码旋转酶B亚基的gyrB基因为靶基因,利用恒温热隔绝式PCR（Insulatedisothermal PCR,IiPCR）,建立一种快速检测蜡样芽孢杆菌的方法。同时,将建立的方法与聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）和实时荧光定量PCR（SYBER Green Ⅰ荧光染料法和TaqMan探针法）检测方法相比较,并应用于不同类型零售食品中的蜡样芽孢杆菌检测。结果表明建立的检测方法能在40 min内迅速判定出结果（+、-、？）;与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌等均无交叉反应,显示出良好的特异性;方法的最低检出限为1.5×102 CFU/mL,优于普通PCR,与实时荧光定量PCR检出限相当;对42份零售食品进行检测,共发现45.23%的样本被蜡样芽胞杆菌污染（19/42）。这一结果与常规PCR检测结果一致,但检测时间至少节省了4 h以上。该研究为蜡样芽孢杆菌提供了一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高、适用于现场实时检测的检测方法。     

牛奶中志贺氏菌PCR检测方法的建立

根据Genbank志贺氏菌侵袭性质粒抗原H (ipaH)基因序列, 自行设计引物, 扩增特异的326 bp核酸片段, 经过优化PCR扩增条件, 建立了志贺氏菌特异、敏感、快速的PCR检测方法, 并对牛奶中的志贺氏菌进行了检测.特异性试验结果表明, 志贺氏菌参考菌株均能扩增出特异的核酸片段, 大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明, 采用试剂盒提取基因组, 该方法的敏感性可达到1.75×102 cfu/mL.人工污染牛奶的模拟检测结果表明, PCR方法的检测限为1.75×103 cfu/mL.     

食品中3种致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

建立用多重聚合酶链式反应(Multiplex polymerase chain reaction,mPCR)同时检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的方法。以沙门氏菌的gyrB基因、单核细胞增生性李斯特菌的gyrB基因、金黄色葡萄球菌的coa基因作为目的基因,分别设计3对引物,通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。采用单重PCR检测时,灵敏度可达0.423ng/mL(沙门氏菌)、2.5ng/mL(金黄色葡萄球菌)和0.36ng/mL(单核细胞增生性李斯特菌);而采用三重PCR检测时,灵敏度较单重PCR有所下降,分别为2.43ng/mL(沙门氏菌)、2.5ng/mL(金黄色葡萄球菌)、3.6ng/mL(单核细胞增生性李斯特菌)。初步建立能同时、快速、灵敏地检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

链置换恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

目的开发单核细胞增生李斯特氏菌快速、简便、准确的链置换恒温扩增(strand displacement amplification,SDA)检测方法。方法根据单核增生李斯特菌特异性基因prfA基因片段,设计链置换扩增特异性引物,建立单核细胞增生李斯特菌SDA快速检测方法,同时对设计的引物的特异性和灵敏度进行研究。结果所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA扩增方法灵敏度达到了7.0×10~2 CFU/mL,检验技术可以特异性地扩增单核增生李斯特菌。结论本试验所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA检验技术具有快速、简便、特异性强的特点,具有在进出口实验室推广应用前景。