MIA影响非洲爪蟾胚胎中胚层的形成

目的:探讨黑色素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)在非洲爪蟾早期胚胎发育中的作用?方法:根据热带爪蟾MIA序列在非洲爪蟾EST数据库中找到MIA序列,利用RT-PCR扩增全长序列并克隆至pCS2+,用于测序?利用RT-PCR检测胚胎发育各阶段MIA mRNA的表达?通过显微注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)敲降MIA;利用整胚原位杂交检测胚层标志性基因的表达?结果:克隆出非洲爪蟾MIA全长序列?在胚胎发育过程中MIA从受精卵开始持续表达?敲降MIA导致胚胎胚孔闭合延缓,中胚层标志基因xbra表达明显受抑,而内胚层标志性基因sox17α表达无明显改变?结论:MIA表达于非洲爪蟾胚胎发育各阶段,敲降MIA抑制中胚层的形成?     

XBP1在非洲爪蟾胚胎发育中的作用

目的：探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1)对非洲爪蟾胰腺发育的影响。方法：利用western blot,原位杂交和免疫染色方法检测XBP1在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用RT-PCR和整体胚胎原位杂交方法检测基因表达变化。结果：XBP1主要表达于非洲爪蟾胚胎发育中的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降XBP1s在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论：XBP1s在胚胎发育早期影响胚层形成,在晚期影响胰腺的发育。     

Gremlin与上皮细胞转分化研究进展

目前研究发现,器官纤维化的发生和发展过程中,上皮细胞转分化是重要的发病机制之一.Gremlin基因首先从爪蟾中枢神经脊中克隆出来,是半胱氨酸结超家族的成员之一,是骨形态发生蛋白( bonemorphogenetic protein,BMP)内源性拮抗剂,在胚胎发育、生长和分化过程中具有重要的调节作用.新近研究提示,Gremlin可能与上皮细胞转分化相关,本文就Gremlin在上皮细胞转分化中的作用的最新研究综述如下.一、Gremlin的生物学特性Gremlin属于BMP拮抗剂家族的成员,它是高度保守的分泌型蛋白,包含潜在的核定位位点、N-连接的糖基化位点和一些磷酸化位点,表现为可溶的和与细胞结合的两种形式[1] Gremlin编码的蛋白有3种,分别命名为Gremlin1、Gremlin2和Gremlin3.人类Gremlin1基因位于染色体15q13-q15,其mRNA全长4175 bp,编码184个氨基酸的蛋白质,其基因编码序列中有一富含半胱氨酸的重复片段.Gremlin2基因位于染色体1q43,编码168个氨基酸的蛋白质,C末端有8个氨基酸环的半胱氨酸结.人类Gremlin3基因位于染色体19q13.2,其氨基酸序列与小鼠CKTSF1B3(DANTE)分子有61.9％的同源性[2].     

IRE1α 影响非洲爪蟾胰腺发育

目的:探讨肌醇依赖性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)对非洲爪蟾胰腺发育的影响?方法:通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降;利用整体胚胎原位杂交方法检测基因表达? 结果:IRE1α表达于爪蟾发育中的胰腺;利用基因特异性反义寡核苷酸敲降IRE1α后,非洲爪蟾肠道明显异常,胰腺内外分泌标志性基因胰岛素?淀粉酶表达显著减少;胰腺前体细胞的标志基因pdx1和p48表达明显减少;敲降IRE1α下游基因X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)后,非洲爪蟾的胰岛素?淀粉酶表达也明显减少?结论:IRE1α影响非洲爪蟾胰腺发育,可能通过XBP1发挥作用?     

XBPl在非洲爪蟾胚胎发育中的作用

目的：探讨Ｘ盒结合蛋白１（Ｘ-ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １,ＸＢＰ１）对非洲爪蟾胚胎发育的影响。方法：利用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、原位杂交和免疫染色法检测ＸＢＰ１在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用ＲＴ-ＰＣＲ和整体胚胎原位杂交法检测基因表达变化。结果：ＸＢＰ１主要表达于非洲爪蟾胚胎发育期的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降ＸＢＰ１ｓ在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论：ＸＢＰ１ｓ在胚胎发育早期可能影响胚层形成,在晚期可能影响胰腺的发育。     

心肌锚定重复蛋白与心力衰竭之间的关系

心肌锚定重复蛋白(cardiac ankyrin repeat protein,CARP)由锚定蛋白重复域(ankyrin repeat domain,ANKRD)1基因编码,ANKRD1与ANKRD2及糖尿病相关锚定重复蛋白同属于肌肉锚定重复蛋白家族,在哺乳动物中的表达高度保守.人的ANKRD基因定位于10号染色体,其cDNA全长1 901 bp,编码含319个氨基酸的多肽,相对分子质量36 kD[1-3].CARP是心肌发生的标志分子之一,在胚胎和胎儿发育时期高水平表达,之后直到成年时期表达水平进行性减少[1-2].     

非洲爪蟾β-synuclein基因的克隆、亚细胞定位及原位表达检测

目的 克隆非洲爪蟾β突触核蛋白基因(xenopus-β-synuclein,xSYNB)并研究其亚细胞定位.方法 以成年爪蟾脑部的总RNA为模板,RT-PCR扩增获得xSYNB基因,并克隆入pGEM-T Easy载体而获得TA-xSYNB重组质粒,亚克隆到pEGFPN1载体上获得pEGFPNl一xSYNB真核表达载体....     

肺癌中bcl—2蛋白表达的研究

细胞凋亡与肿瘤发生的关系是目前肿瘤研究的"热点"之一.Bcl-2基因作为抑制细胞凋亡的基因受到了广泛的关注.Bcl-2基因定位于人染色体18q21,编码一相对分子量为25kD的线粒体内膜蛋白,该种蛋白表达时,可抑制细胞凋亡,从而导致癌变[1、2、3].本文通过对115例肺癌石蜡切片做免疫组化检测,探讨Bcl-2蛋白表达状况及意义.     

Betatrophin功能及表达的研究进展

Betatrophin作为高度保守的肿瘤相关抗原基因,于2004年由Dong等在患者血清中发现[1].在人类的基因序号为C19orf80,定位于染色体19p13.2,在小鼠中基因序号为Gm6484,定位在9号染色体上[2].大量研究[2-5]证实,betatrophin是一种新型糖脂代谢影响因子,主要在肝脏、白色脂肪、棕色脂肪中表达,转录翻译为可在人血浆中检测到分泌蛋白.目前普遍认为其可能与血糖、血脂、肝肾功能、某些激素、年龄等代谢参数存在重要的联系,但对betatrophin的生理机制和影响因素尚存争议.本文为进一步探究betatrophin与糖、脂代谢的关系,对血betatrophin水平调节的可能因素进行简要综述,旨在为机制研究提供依据.     

OCT4基因在体细胞肿瘤的研究进展

OCT4基因是POU转录因子家族中的成员,系8聚体结合转录因子,在人类定位于人6号染色体,能转录不同的信使RNA亚型(isoform),翻译几种不同的蛋白质.研究发现OCT4基因主要表达于胚胎干细胞和原始生殖细胞,随着干细胞的分化成熟其表达量逐渐下调.胚胎干细胞的信号调控通路中OCT4、SOX2、Nanog处于核心位置.     

ETS1在多巴胺能神经元发育中的作用

【立论依据】 帕金森病是第二大神经系统退行性病变,主要多发于60岁以上的老年人。其基本病理改变是特异性多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死,数量减少,致使多巴胺释放减少,但具体机制不明。从多巴胺能神经元发育的角度或许能解释多巴胺释放减少的分子机制。多巴胺神经元发育的各个阶段都有转录因子基因参与调控, 如SHH、FGF、Nurr1、Pitx3、Mash1 等。这些因子决定了多巴胺能神经元发育的命运并控制了一些重要的发育过程。作为转录因子,ETS1表达于发育中的脑组织。在前期研究发现ETS1影响胚胎神经发育的基础上,过表达ETS1抑制酪氨酸羟化酶(TH)的表达。但ETS1在多巴胺能神经元发育的哪一阶段发挥作用,如何发挥作用均未阐明。 【设计思路】 利用非洲爪蟾作为模式动物,通过过表达或封闭ETS1表达,检测在多巴胺能神经元发育的不同阶段标志基因的表达,探讨ETS1影响多巴胺能神经元发育的阶段;进而寻找ETS1的下游靶基因。 【实验内容】 选择分裂良好的非洲爪蟾胚胎,利用显微注射方法注射ETS1 mRNA或反义寡核苷酸,实现ETS1的过表达或基因封闭,在神经发育的不同阶段收集胚胎,提取RNA或蛋白质,利用定量RT-PCR、整胚原位杂交及蛋白质印迹方法检测标志基因的表达改变。之后,通过萤光素酶报告基因方法检测ETS1对其靶基因的转录调控。 【材料】 非洲爪蟾胚胎,ETS1 mRNA、反义寡核苷酸,原位杂交用探针及其他试剂,RT-PCR、蛋白质印迹试剂,报告基因检测系统,其他常规试剂。 【可行性】 本课题建立在前期预实验的基础上,研究方向明确;非洲爪蟾胚胎体积大,易于进行显微注射;胚胎在体外发育,便于随时观察表型。 【创新性】 发现新的调节多巴胺能神经元发育的转录因子ETS1及其作用机制,为探讨帕金森病的发生机理提供新的线索。     

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的构建慢病毒介导的Noggin RNAi干扰序列，并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的mRNA设计四条干扰序列，并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体，将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞，获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞，利用Puromycin进行筛选，获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示，四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果，但只有shNoggin-1（P<0.01）对其表达影响显著。Western Blot结果显示，四种干扰序列中只有shNoggin-1（P<0.01）对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论 获得了一种Noggin基因的干扰序列，该序列能够干扰Noggin基因mRNA的稳定性，从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因，从而用于研究Noggin基因的功能。     

Noggin蛋白对MCF-7细胞增殖、侵袭能力的影响

目的观察Noggin蛋白对乳腺癌细胞MCF-7增殖、侵袭能力的影响。方法以Noggin重组腺病毒感染乳腺癌细胞株MCF-7,MTT法检测Noggin对MCF-7细胞增殖能力的影响,划痕修复实验及Transwell细胞侵袭实验检测其运动和侵袭能力的改变,Real-time PCR和Western blot检测CXCR4和MMP1基因的表达改变。结果过表达Noggin蛋白的MCF-7细胞增殖能力增强(P<0.05);划痕修复实验提示过表达Noggin蛋白的MCF-7细胞划痕愈合延迟;Transwell细胞侵袭实验提示与空病毒组相比,Noggin组穿膜细胞数显著降低(55±4 vs 25±3,P<0.05)。RT-PCR和Western blot结果:过表达Noggin后,MCF-7细胞中CXCR4和MMP1基因表达下调。结论 Noggin蛋白可抑制乳腺癌细胞MCF-7的运动和迁移,可能与下调CXCR4和MMP1基因的表达相关。     

IRE1α 通过UPR 影响非洲爪蟾胚胎发育

目的:探讨IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中是否介导未折叠蛋白反应(UPR),并在衣霉素(tunicamycin,TM)诱导的胚胎发育畸形中发挥挽救作用?方法:利用TM处理胚胎激发内质网应激;应用显微注射mRNA方法实现基因过表达,通过注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)实现基因封闭;RT-PCR检测XBP1 剪切情况?结果:XBP1 剪切随IRE1α过表达及封闭而增加或减少;TM处理导致胚胎发育畸形,XBP1剪切增加,封闭XBP1可部分挽救发育畸形;封闭IRE1a可明显挽救发育畸形,XBP1剪切恢复?结论:IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中介导UPR,封闭IRE1α可逆转TM诱导的胚胎发育畸形,部分通过XBP1途径发挥作用?     

一种在紫外敏感型视锥细胞中特异表达tdTomato的转基因斑马鱼系的构建

目的 鉴于目前对斑马鱼视锥细胞视蛋白运输机制并不明确,且缺乏相应的抗体,本实验拟构建一种可以在视锥细胞中特异表达荧光的转基因斑马鱼。方法 我们利用编码紫外敏感型视蛋白基因（sws1）的启动子,构建了一种在紫外敏感型视锥细胞中特异表达红色荧光蛋白tdTomato的转基因斑马鱼。与此同时,我们将tdTomato荧光蛋白与非洲爪蟾Rhodopsin蛋白末端44个氨基酸相融合,将该融合蛋白定位于紫外敏感型视锥细胞的外节段,进而可模拟内源性视蛋白的定位。结果 我们共筛选出三种不同品系的转基因斑马鱼,经过免疫组化分析,确定其中一种转基因品系是正确的目标品系。结论 该转基因斑马鱼的构建将会为进一步研究视锥细胞中视蛋白的运输机制提供帮助。     

新基因FAM92A1的生物信息学分析及功能预测

目的:运用生物信息学方法对新基因FAM92A1功能进行预测分析,为进一步深入研究FAM92A1功能奠定基础。方法:利用多种生物信息学分析软件,分析FAM92A1基因的表达谱、保守性及其编码蛋白的结构和定位等特征,根据结构预测其功能。结果:该基因表达广泛,高度保守,有多个选择性剪接变异体。编码蛋白属于DUF1208保守结构域家族,与猩猩、小鼠、大鼠、鸟、非洲爪蟾、斑马鱼和果蝇的相似性分别为91%、84%、82%、74%、67%、65%、26%。它含有一个卷曲螺旋结构和多个磷酸化位点,无信号肽及跨膜结构。亚细胞定位预测其定位于细胞核。结论:利用生物信息学方法可初步预测FAM92A1为一细胞核内具有调节作用的蛋白质,其在细胞增殖和分化的精确调控方面可能起着重要作用。     

爪蟾卵母细胞固醇调控通路的建立及姜黄素的作用

[目的]在爪蟾卵母细胞中建立人类SCAP/SREBP固醇调控系统,利用此系统研究姜黄素对SCAP/SREBP调控通路的作用。[方法]构建带有绿色荧光报告蛋白基因的PLXRN-4SRE-fpa质粒,将构建质粒和其他几种质粒分别提取混和成实验组质粒和对照组质粒,通过微注射的方法分别共注射到Ⅴ、Ⅵ爪蟾卵母细胞核内,与不同浓度的姜黄素共孵育3天,使用荧光定量PCR检测荧光表达量。[结果]相同浓度的姜黄素对注射含有固醇调节元件质粒的卵母细胞荧光表达量要明显高于不含相应元件的质粒。[结论]构建的质粒pLXRN-4SRE-fPA能在爪蟾卵母细胞中有效地应答SCAP、SREBP调控因子;通过影响SCAP/SREBP调控通路调节SRE-1下游基因的表达可能是姜黄素调脂作用的机理之一;利用核内共注射的方法在爪蟾卵母细胞中建立的SCAP/SREBP调控系统可作为SCAP配体类药物快速筛选和作用机制研究的细胞模型。     

CSX/Nkx2.5基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的表达

目的:检测CSX/Nkx2.5基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的mRNA表达变化及其蛋白定位.方法:取大鼠胚胎d12、d15、d17、d19心脏,采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测心脏组织中CSX/Nkx2.5基因mRNA的表达丰度,并应用免疫组化的方法对其进行定位分析.结果:在大鼠胚胎d12、d15、d17、d19心脏中,CSX/Nkx2.5 基因mRNA均有表达,且呈逐渐上调趋势;其蛋白主要表达于心房、心室、肌小梁等处心肌组织,而在心内膜、心外膜、瓣膜、流出道、大血管等处未见表达.结论:CSX/Nkx2.5 基因的表达随大鼠胚胎心脏的生长发育逐渐上调,且特异表达于胚胎心脏心肌细胞的细胞核,与心脏发育密切相关.     

新基因AY358935的生物信息学分析及功能预测

目的对新基因AY358935的功能性质进行生物信息分析,为深入研究该基因功能奠定基础。方法利用生物信息学分析软件,分析新基因AY358935及其编码蛋白的性质、定位、结构、表达谱等特征,并根据相关信息预测其生物学功能。利用Western blotting检测病毒感染早期AY358935的表达变化。结果AY358935基因进化保守,与马、小鼠、斑马鱼、非洲爪蟾的相似性分别为74%、60%、38%、33%。亚细胞定位于线粒体的可能性大。含有一个N末端信号肽序列和单次跨膜结构,多个磷酸化位点,二级结构主要是α螺旋和无规则卷曲。在正常组织和癌组织表达广泛,并受双链RNA依赖蛋白激酶的表达调控。AY358935蛋白表达在水泡性口炎病毒感染2h后即明显上调。结论初步预测AY358935为具有重要功能的小分子分泌蛋白,可能参与细胞增殖和抗病毒天然免疫调控。     

白血病与NUP98-HOX融合基因

白血病是一种造血组织的恶性疾病,是一组高度异质的血液病.其特点是某一类型的白血病细胞在骨髓或其他造血组织中的肿瘤性增生.目前,尽管没有一个完整的理论用以解释白血病的发病机理,但是白血病细胞遗传学研究表明这类疾病的发生大多与染色体畸变有关,其中最常见的是染色体相互易位或倒位[1].染色体易位可引起相应座位上的基因表达异常或形成致病的融合基因,这些改变常会影响正常细胞的增殖、分化及凋亡等基本生命活动过程,从而为肿瘤发生、发展提供了必要的条件.如Ph染色体中含有1个BCR-ABL融合基因,该基因产生的异常产物增强了酪氨酸激酶的活性,且逃脱了"生长因子一受体复合物"的控制,从而引起CML.核孔复合物(nucleoporin gene,NPC)是近年来发现的贯穿于核膜作为细胞核与细胞质物质交换的惟一通道,在细胞正常的生长与分化中发挥着重要作用.研究已发现核孔蛋白结构与功能的异常与数种人类疾病相关,与肿瘤关系尤为密切.在许多白血病中都可以检测到与核孔蛋白Nup98有关的染色体易位、融合基因及转录产物,说明核孔蛋白Nup98的异常与白血病关系密切.其中,对NUP98-HOX融合基因的研究引起了广泛的关注,本文就此做一综述.