重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为：诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。     

大肠杆菌表达古菌基因的发酵条件研究

对重组大肠杆菌BL21(DE3)表达古菌基因的发酵条件进行了研究,最终确定葡萄糖浓度为10g/L,蛋白胨浓度为19g/L,酵母膏浓度为11.5g/L,硫酸铵浓度为4g/L,磷酸盐浓度为100mmol/L,硫酸镁浓度为10mmol/L.当菌体密度(OD600)达到7.0左右时,加入乳糖至终浓度1g/L,继续诱导培养8h,古菌高温酸性α-淀粉酶酶活力最高达192U/mL.在分析了该菌对葡萄糖利用情况的基础上,对该菌进行了pH-stat流加培养,36h菌体浓度与高温酸性α-淀粉酶活力分别达到67和600U/mL,比摇瓶最好结果分别提高了5.1和3.1倍.     

基于角质酶共表达策略的大肠杆菌胞外生产耐高温α-淀粉酶及其发酵条件优化

在前期工作中通过分子改造提高了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶在高温酸性条件下的稳定性,同时改良了催化效率。为了实现α-淀粉酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞外高效表达,作者尝试采用共表达嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶来增强大肠杆菌膜透性,同时优化诱导策略以提高重组α-淀粉酶的胞外表达。首先构建了能同时表达角质酶和α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pETDuet-amy-cutinase,并将此菌株与能单独表达α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pET-20b-amy进行摇瓶和3 L发酵罐的产酶发酵对比。结果显示,共表达菌株在胞外产酶方面具有明显的优势。进一步对共表达菌株的诱导条件进行优化,在32℃、诱导剂为0.15μmol/L IPTG与0.5 g/(L·h)乳糖条件下,发酵32 h后胞外α-淀粉酶最高酶活力可达6.05×10~4U/m L,是单表达菌株摇瓶发酵水平的28.3倍。此时胞外重组α-淀粉酶质量浓度为8.92 g/L,重组蛋白质的分泌效率为93.2%。     

产耐高温Fe-SOD(H171A)重组大肠杆菌发酵条件的优化

超氧化物歧化酶因其在药物和化妆品等行业体现出重要应用价值,近年来为世人所关注。为了提高该酶的表达量,我们针对E.coli BL21(DE3)/p ET28a(+)-SOD重组表达系统,运用单因素实验及正交实验相结合的手段,确定了产耐高温Fe-SOD(H171A)重组大肠杆菌的最优培养基成分及最优诱导条件。实验结果表明,重组细菌在当向培养基中加入亮氨酸至终浓度为1.20g/L、氮源为30 g/L酵母粉并且调整碳氮比为1时,达到了最优诱导效果。另外当诱导条件为诱导剂浓度0.15 mmol/L,诱导温度37℃,诱导时间10 h时,重组菌达到了最优诱导效果。在优化条件下,菌体密度达到最高并且目的蛋白表达量为全菌体蛋白的52.90%,比基础培养基发酵条件高出0.68倍。     

产耐酸性α-淀粉酶菌株固态发酵条件的优化

对产耐酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株AS-Y的固态发酵条件进行了优化.经过单因素实验和正交试验,影响产耐酸性α-淀粉酶的菌株产酶量的主要因素为含水量＞接种量＞附加氮源＞Ca2+.固体发酵条件中,水∶麸皮为1∶1,麸皮量为15 g,接种量为4 mL,温度为30 ℃～32 ℃.发酵培养基中,麸皮∶硫酸铵为1∶0.05,CaCl2为0.01 g.在上述最佳的发酵条件下,确定其固体发酵时间为60 h～72 h,酶活达到286.64 U/g.     

重组α-1,3-葡萄糖苷酶的毕赤酵母表达及发酵优化

Acremonium sp. S4G13来源的α-葡萄糖苷酶基因连接到p PIC9K载体上并在Pichia pastoris GS115中表达。在此基础上对重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-AGL产重组α-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了单因素优化试验,结果表明最优条件为:生长阶段接种量10%,甘油体积浓度3%,初始pH 6.0;诱导阶段甲醇初始添加量1%,甲醇补加量0.5%,装液量10%,诱导温度25°C,山梨醇添加量6 g/L。在最优条件下发酵120 h,酶活可达7.8 U/mL,相比优化前酶活1.22 U/mL提升了5.4倍。     

产耐酸陛α-淀粉酶菌株固态发酵条件的优化

对产耐酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株AS-Y的固态发酵条件进行了优化。经过单因素实验和正交试验，影响产耐酸性α-淀粉酶的菌株产酶量的主要因素为含水量〉接种量〉附加氮源〉Ca^2＋。固体发酵条件中，水：麸皮为1：1，麸皮量为15g，接种量为4mL，温度为30℃～32℃。发酵培养基中，麸皮：硫酸铵为1：0．05，CaC12为0．01g。在上述最佳的发酵条件下，确定其固体发酵时间为60h～72h，酶活达到286．64U/g。     

Clostridium thermosulfurogenes β-淀粉酶基因重组菌的发酵研究

重组菌高密度发酵是获得微生物β-淀粉酶高产的方法。将重组热硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes耐高温β-淀粉酶基因表达菌株p ETB2-O/BL21-(DE3)Star,分别在HD培养基和改良M9培养基中按p H-stat补料策略进行分批补料发酵,在30℃条件下进行诱导表达。结果重组菌在HD培养基的分批补料发酵中,IPTG诱导32 h菌体密度OD600值达到30.0,β-淀粉酶活力最高为2063.3 U/m L,在菌体密度为分批发酵的1.6倍情况下,总酶活力提高到分批发酵的3.1倍;在改良M9培养基的分批补料发酵中,IPTG诱导36 h菌体密度OD600值为19.9,同时β-淀粉酶活力达到1663.4 U/m L,在菌体密度为分批发酵的1.7倍条件下,总酶活力提高到分批发酵的2.0倍。     

渗透压诱导表达重组Clostridium thermosulfurogenes β-淀粉酶基因

以热硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes基因组为模板,PCR扩增出β-淀粉酶基因;将该基因克隆到pET-22b(+)载体上,转入大肠杆菌BL21-SI,采用NaCl形成的高渗透压诱导表达。研究了不同诱导条件对重组菌产β-淀粉酶的影响,结果以菌体密度达到OD600为0.6,诱导剂NaCl浓度为0.6 mol/L,诱导温度为35℃最佳。重组菌以LBON为培养基分批发酵时,由于营养限制,菌体密度OD600仅为4.60,β-淀粉酶活力为118U/mL。采用pH-Stat分批补料发酵时,在菌体密度仅是分批发酵的2.35倍的条件下,得到6.12倍的产酶量,酶活力达722U/mL。重组β-淀粉酶70℃水解可溶性淀粉3h的麦芽糖转化率为62.2%,高于大麦β-淀粉酶的转化率。     

重组大肠杆菌产双乙酰还原酶的发酵条件优化

光学纯2,3-丁二醇是重要的手性合成砌块。采用双乙酰还原酶催化还原双乙酰底物是一种合成光学纯2,3-丁二醇的绿色方法。作者在摇瓶中对产双乙酰还原酶重组大肠杆菌的发酵培养基及诱导条件进行了优化。优化后的发酵培养基组成为:甘油5 g/L,酵母浸膏10 g/L,鱼粉蛋白胨5 g/L,(NH_4)_2SO_41.5 g/L,柠檬酸钠5 g/L,KH_2PO_41 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,NaCl 2 g/L;优化后的诱导条件为37℃,IPTG终浓度为0.1 mmol/L。在优化培养基中,37℃和0.1 mmol/L IPTG条件下诱导发酵6 h,单位菌体(干重)产双乙酰还原酶量达13.84 kU/g,产酶水平达33.65kU/L,分别为基础培养基的2.04和4.23倍,LB培养基的1.16和1.71倍。在此最优条件,在3 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌产双乙酰还原酶的验证,发酵8 h时酶活最高,单位菌体产双乙酰还原酶量达14.09 kU/g,产酶水平达64.62 kU/L。本研究为高效制备可用于不对称还原合成光学纯2,3-丁二醇的双乙酰还原酶奠定了基础。     

一株产淀粉酶海洋菌的筛选及发酵条件的研究

研究筛选产淀粉酶海洋菌并对发酵条件进行了优化.采用3,5-二硝基水杨酸试剂显色法对菌种复筛;研究了碳源、氮源、各种理化因素等培养条件对细菌产淀粉酶的影响.确定W11菌为研究菌,初步鉴定为弧菌:最佳碳源为麸皮,最佳氮源为蛋白胨,晟适初始pH值为7.04～7.70.培养温度、接种量、装液量对细菌产酶有较大影响,正交试验表明:麸皮10g/L,蛋白胨10g/L,250mL三角瓶中装液75mL,温度33℃时,酶活可达到325.14U/mL.比未优化前提高了2.71倍.     

Bacillus stearothermophilus麦芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis中的重组表达及发酵优化

为了实现Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶基因amyM(EC 3.2.1.133)在枯草芽孢杆菌中的重组表达,以opt-amyM/T质粒为模板进行PCR扩增得到目的基因,与表达载体pHY300PLK进行重组连接后转入宿主菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中进行表达。在TB培养基中发酵培养48 h,麦芽糖淀粉酶酶活达到250.7 U/mL。继续对重组菌氮源种类及复配、氮源质量浓度、碳源质量浓度等摇瓶发酵条件进行优化,确定其最佳产酶条件为:复合氮源为酵母浸膏25 g/L和大豆蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、培养基初始pH 6.5、最适培养温度41℃;在此条件下麦芽糖淀粉酶酶活可达396.7 U/mL,是优化前的1.6倍。在此基础上进一步对麦芽糖淀粉酶进行酶学性质进行测定:麦芽糖淀粉酶最适温度为60℃,最适pH为5.5,半衰期为325 h,Km为0.95 g/L,比活为2646 U/mg。     

重组麦芽糖转葡萄糖基酶工程菌发酵条件的优化

对重组麦芽糖转葡萄糖基酶工程菌的发酵条件进行优化,通过单因素试验确定该菌株产麦芽糖转葡萄糖基酶的最佳发酵培养基为：糖蜜0.025g/mL、胰蛋白胨0.015g/mL、MgSO4 ·7H2O与K2HPO4的质量为7:1、FeSO4 ·7H2O 0.5g/L;以葡萄糖氧化酶法为指标测得最佳摇瓶发酵条件为：装液量100mL/250mL、转速200r/min、接种量5%、初始pH 7.0、最佳温度37℃、诱导阶段OD600nm=0.6、诱导温度30℃、诱导时间5h、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度1mmol/L。经优化,重组麦芽糖转葡萄糖基酶的酶活力可达950U/mL,比初始条件下提高了近7倍。     

黑曲霉木聚糖酶的同源表达及其高产木聚糖酶发酵条件的优化

构建的木聚糖酶xyn B表达载体p BS-XTP在黑曲霉(Aspergillus niger)表达系统中实现了高表达,并对基因工程菌A70的发酵特性及产木聚糖酶的条件进行了优化。采用单因素实验法和L9(34)的正交实验优化菌种产酶条件,优化得到摇瓶产酶条件为:玉米芯质量浓度80 g/L,麸皮质量浓度18 g/L,糖蜜质量浓度14 g/L,Na NO3g/L,用30 m L无氮Mandels营养液配制发酵液。在发酵温度为28~30℃,接种量为0.5%,装液量30m L/瓶,摇床转速为220 r/min,发酵时间96 h,菌株A.niger A70产酶水平达12 664 U/m L,是优化前的3.5倍,较出发菌株A.niger A327产酶水平提高约60倍。     

重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（＋）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化

研究自行构建的产β-葡聚糖酶的工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl在LB培养基中的生长特性,考察种子液的菌龄、培养基起始pH、接种量及诱导起始时发酵液菌浓度等对β-葡聚糖酶产生水平的影响;通过正交试验确定诱导剂IPTG及乳糖添加量、诱导温度及诱导剂作用时间.结果表明:培养基起始pH 7.0,对数生长中期的种子液(OD600为0.35)以接种量(体积分数)10%接入摇瓶发酵培养,37 ℃,200 r/min培养约3 h,菌液OD值达到1.0左右,添加终浓度分别为0.033 6 mmol/L的IPTG及10 mmol/L乳糖,24℃诱导6 h,发酵液清液中酶活达到最高(336.33 U/mL),菌体生长量为1.12 g/L,发酵液中总酶活达到459.32 U/mL,是原始菌株在相同条件下所产酶活的6.62倍.采用优化培养条件及诱导剂作用条件,重组菌在TB培养基中酶活水平进一步提高,诱导剂作用10 h,发酵清液中酶活为1 090.31 U/mL,总酶活1 570.83 U/mL,是原始菌在该条件下酶活的19.73倍,显示出重组菌具有广阔的工业化应用前景.     

Bohai sea-9145重组脂肪酶基因工程菌的发酵表达条件优化

为提高大肠杆菌(E.coli)基因工程菌产Bohai sea-9145重组脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)的能力,有效制备Bohai sea-9145脂肪酶。采用单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken响应面设计实验,对该重组酶基因工程菌的发酵表达条件进行了优化。最终确定的最佳条件是:接种量为1.5%,培养基的初始p H为8.0,诱导剂IPTG的添加时间为3.5 h,终浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为15 h,诱导温度为16℃,摇床转速为200 r/min,经优化后该菌的产酶量是优化前的9.72倍。     

重组大肠杆菌产Bacillus subtilis 168来源γ-谷氨酰转肽酶的摇瓶发酵优化

为实现来源于Bacillus subtilis的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)高效胞外分泌表达,以基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-20b(+)/ggt为出发菌株,对其发酵产酶的诱导条件和培养基进行优化。最终确定其最优发酵培养基为:10 g/L甘油,21 g/L酵母粉,7 g/L蛋白胨,130 mmol/L磷酸盐;发酵条件为:37℃、200 r/min培养4 h,加入0.2 mmol/L IPTG后转入25℃,诱导40~48 h,优化后酶活达到81.2 U/m L,是未优化前的1.9倍。本研究结果为目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产γ-谷氨酰转肽酶的最高酶活,为该酶的工业化生产奠定了基础。     

重组角质酶的制备及合成乙酸乙酯条件优化

为了实现镰孢菌角质酶的高效表达,对重组菌株P. pastoris KM71/pPIC9K-ScCuA在3 L发酵罐进行了发酵工艺优化,获得的最优发酵条件为:诱导温度28℃,初始诱导菌浓OD600为100,诱导阶段甲醇体积分数为1%条件下进行诱导产酶。在该条件下发酵138 h时上清酶活可达到最大值419 U/mL,是优化前的2倍。对重组角质酶在有机溶剂中合成乙酸乙酯的酯化条件进行了优化,结果表明,当底物乙酸浓度为0.1 mol/L,乙醇浓度为0.15 mol/L,温度50℃,在异辛烷中反应16 h,乙酸乙酯可以达到最大转化率94.12%。     

双酶协同法糖化玉米及L-乳酸发酵工艺的研究

通过均匀试验对双酶协同作用进行了玉米糖化条件、发酵条件的研究,得出最佳糖化条件为：糖化温度64℃、α-淀粉酶添加量0.0435g/20g玉米粉、糖化酶添加量0.0742g/20 g玉米粉、pH 5.7、糖化时间6h,还原糖含量可达119.96g/L;最佳发酵条件为：发酵温度37℃、接种量10%、发酵时间48 h,添加麸皮量为30g/100g玉米粉,乳酸得率136.92g/L.     

重组运动发酵单胞菌HYMX发酵葡萄糖产乙醇工艺的优化

用Tn5转座技术将七个基因（Pfu-sHSP,yfdZ,metB,xylA,xylB,tktA and talB）导入到原型菌CP4中,得到重组菌HYMX;并用响应面方法优化重组菌的发酵工艺。结果表明,最佳发酵工艺条件为葡萄糖质量浓度285 g/L,初始pH值为6.5,发酵时间63 h,发酵温度32 ℃,接种量10%,酵母提取物10 g/L。优化后最高乙醇产量为137.11 g/L,比优化前的最高乙醇产量130.9 g/L提高了4.53%,比原型菌的72.17 g/L提高了89.98%。 关键词：中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（20１5）05-0118-05 doi: