TPO、PDGF、IL-11在脐血巨核细胞生长和分化中的作用

目的 比较血小板生成素（TPO）、血小板源性生长因子（PDGF）、白细胞介素-11（IL—11）在促进巨核系增殖、分化及成熟过程中的不同效果，初步探讨巨核细胞分化过程中相关信号通路蛋白的表达。方法用免疫磁珠法分离纯化脐血CD34^＋细胞，在液体培养体系中经TPO、PDGF-BB、干细胞因子（SCF）、IL-1β、IL-3、IL-6及IL—11等细胞因子组合的诱导，检测有核细胞（NC）总数和CD41^＋、CD61^＋表达，蛋白印迹实验（Westernblot）分析巨核细胞分化过程中相关信号通路蛋白的表达。结果 TPO对巨核系的扩增效果明显强于PDGF和IL-11，而PDGF、IL—11的扩增效果差别不大；含IL—11的因子组，NC及CD41^＋、CD61^＋细胞的总数都有明显增加，但CD41^＋、CD61^＋细胞比例不高；脐血CD34^＋细胞在TPO、SCF、IL-1β、IL-3、IL-6及IL—11等因子作用下，随着培养时间的延长，促分裂原活化蛋白激酶42／激酶44（MAPKp42／p44）蛋白表达并无明显改变，蛋白激酶B蛋白亦未见明显变化，但磷酸化的p42和p44的表达却明显增加。结论 在体外诱导脐血CD34^＋细胞向巨核系定向分化过程中，TPO起着最重要的作用；TPO联合其他造血生长因子刺激脐血CD34^＋细胞向巨核细胞分化和增殖过程中，刺激了MAPKp42／p44分子的磷酸化，从而激活和维持巨核细胞的增殖。     

抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化和成熟过程中的作用

目的 研究抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化和成熟过程中的作用。方法采用PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化,RNA干扰阻断Bcl-xL在K562细胞向巨核细胞诱导分化中的表达,RT-PCR和流式细胞仪技术检测其改变。采用免疫磁珠从正常骨髓中富集CD34＋细胞,在无血清培养下用TPO诱导其向巨核细胞分化,免疫组织化学和流式细胞仪技术观察分化过程中Bcl-xL的表达改变。结果 PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化24h后,CD61＋细胞百分比迅速增加,并且在72h内维持较高的阳性率;用siBcl-xL干扰后72h内,CD61＋细胞百分比只有轻度增加,同时RT-PCR检测显示24h后Bcl-xLmRNA表达显著减少,流式细胞检测显示Bcl-xL蛋白的表达也相应降低。正常骨髓中CD34＋细胞经TPO诱导后,在培养5—20d间Bcl-xL蛋白表达阴性的巨核细胞随着培养时间延长逐渐增多,免疫组织化学检测显示未成熟的巨核细胞Bcl-xL蛋白表达呈强阳性,而在成熟的巨核细胞中表达为阴性。结论抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化过程中发挥重要作用,而在巨核细胞发育晚期Bcl-xL蛋白的表达下调可能是巨核细胞成熟的关键,并与成熟巨核细胞的特殊凋亡发生密切相关。     

TPO对体外巨核细胞增殖、分化的影响

目的研究血小板生成素(TPO)对人巨核细胞白血病细胞(DAMI)增殖、分化的影响。方法采用体外培养巨核细胞,将不同浓度TPO加入细胞培养液,CCK-8法检测TPO最佳刺激浓度;培养液中加入TPO,台盼蓝检测细胞增殖活力,巨核细胞乙酰胆碱脂酶染色检测细胞集落。流式细胞仪检测巨核细胞CD4l表达。结果 TPO浓度为250ng/ml时刺激作用明显。培养液中加入TPO后,巨核细胞集落计数、CD4l表达均明显增加。结论 TPO促进体外巨核细胞增殖、分化。     

脐血CD34+细胞向巨核细胞的分化扩增及基因的表达变化

目的研究脐血CD34+细胞向巨核细胞的诱导分化及体外扩增,并观察此过程中巨核细胞特异性基因表达的变化。方法免疫磁珠法分离获得CD34+细胞培养在无血清无基质培养基中,采用TPO+SCF+IL 3+IL 6、 TPO+SCF+IL 3、 TPO+SCF三种不同因子组合对其诱导分化及扩增。收集3、7、10、14?d的扩增产物,运用荧光显微镜检测巨核细胞的表面标志;流式细胞术（FCM）检测巨核细胞的凋亡;对巨核细胞进行DNA含量检测以及荧光定量PCR检测特异性基因表达的变化。结果分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增,随培养时间的延长,CD34+/CD41+细胞数第7天达最高值,之后逐渐下降;而CD41+、CD42b+、CD61+细胞随培养时间的延长表达量逐渐增高。DNA含量检测发现,随着培养天数的增加,多倍体细胞所占的百分比增加。三种因子组合中TPO+SCF+IL 3+IL 6组扩增效率最高。荧光定量PCR显示转录因子GATA 1、NF E2、TXS、GPIIb和HPRT在第7天表达量最高,之后下降。凋亡转录因子APAF 1随培养天数的延长表达量增加。结论脐血CD34+细胞在体外可向巨核细胞诱导分化及扩增,其基因表达的变化也支持这一结论。     

脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究

目的研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.     

血小板生成素和白细胞介素-11对慢性特发性血小板减少性紫癜巨核细胞的影响

目的　探讨重组人血小板生成素 (rh TPO)及联用重组人白细胞介素 - 11(rh IL - 11)对慢性特发性血小板减少性紫瘢 (CITP)患者骨髓巨核祖细胞增殖和成熟的影响。方法　采用血浆凝块法对 2 1例 CITP患者骨髓巨核祖细胞进行体外培养 ,培养体系中加入不同浓度的 rh TPO,或同时加 rh IL - 11两者联用。培养 14天后经 SZ-2 1(GP a)单抗和 ABC试剂盒染色观察集落生长数 ,用 MCDS- 2 0 10型超清晰度骨髓细胞分析系统进行巨核细胞的面积和直径测定。结果　 CITP组骨髓巨核细胞面积及直径明显低于对照组 (P<0 .0 5 )。 rh TPO对 CITP患者的巨核细胞集落形成单位 (CFU - MK)总集落数、巨核细胞直径与面积均有促进作用 ,但无浓度依赖性。体外最适浓度为 10 ng/ ml;rh TPO与 rh IL - 11联用组较单用组的 CFU - MK、总集落数及面积、直径均显著增加。结论　 CITP患者骨髓巨核细胞存在成熟障碍 ,体外 rh TPO单用及与 rh IL - 11联用均可促进 CITP患者巨核祖细胞的增殖与成熟 ,其联用较单用促进作用更强     

脐血巨核祖细胞的体外扩增

目的联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)和肝素用脐血CD34 细胞定向扩增巨核祖细胞.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34 细胞,用TPO、IL-11和肝素定向扩增巨核祖细胞,巨核祖细胞集落分析(CFU-MK)测定巨核祖细胞扩增倍数,流式细胞术检测巨核祖细胞分化过程中不同细胞组群(CD34 、CD41a 、CD61 、CD34 CD41a 和CD41a CD61 )的变化,免疫组织化学染色(CD41a)和透射电镜观察巨核细胞形态及超微结构,血小板体外活化实验及非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞功能.结果单用TPO 7 d时,CD34 CD41a 细胞扩增(4.0±1.7)倍;与IL-11联用后扩增到(10.5±4.8)倍;再加入肝素后扩增达(29.9±6.4)倍,TPO IL-11 肝素组扩增倍数为TPO组、TPO IL-11组的7.5、2.85倍,与两组相比差异均有显著性(P＜0.05).TPO IL-11 肝素组巨核祖细胞中大集落(＞50个细胞/集落)达(106.8±26.9)倍,较TPO、TPO IL-11组均有明显增加(P＜0.05).将扩增第7天的巨核细胞静脉输注于经放射预处理的非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠,可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率.电镜显示扩增的巨核细胞有一定的界膜发育等成熟特征,体外血小板活化实验证实,扩增的巨核细胞在体外可产生血小板,有正常巨核细胞功能.结论TPO、IL-11和肝素组合的培养体系可有效扩增脐血巨核祖细胞.     

比较卡铂对乳腺癌细胞及血小板生成素作用下巨核细胞的影响

目的 研究化疗药物卡铂对乳腺癌细胞和使用血小板生成素(thrombopoietin,TPO) 的巨核细胞(MO7e) 的影响.方法 MTT 法测定不同浓度的TPO 对巨核细胞株MO7e 作用24h、48h、72h 的影响,作出增殖曲线.测定不同浓度卡铂对乳腺癌MDA-MB-453 细胞和使用TPO 的MO7e 细胞作用24h、48h 的抑制率,求出半数抑制浓度(IC50),比较两者的IC50.结果 MO7e 细胞增殖率随TPO 浓度增大而增大,TPO 浓度为256ng/ml 时进入平台期.卡铂对MO7e 细胞的IC50 约为对乳腺癌细胞IC50 的10 倍.结论 TPO 可促进巨核细胞增殖,卡铂对乳腺癌细胞的抑制作用明显高于对使用TPO 的巨核细胞的抑制作用.     

血小板生成素通过修复化疗后骨髓内皮祖细胞促进巨核细胞造血

目的 探索血小板生成素（TPO）能否通过修复大剂量化疗后患者的骨髓内皮祖细胞（BM-EPC）恢复其对巨核细胞的造血支持作用。方法 选取23例血液系统恶性肿瘤患者化疗后30 d的骨髓以及10例健康人骨髓作为实验标本。采用表面特异性抗原CD34，CD309，CD133对BM-EPC进行鉴定；使用CCK8分析TPO是否可促进血液肿瘤患者化疗后BM-EPC增殖及其最佳作用浓度。设置TPO处理组为实验组，无TPO为对照组，健康人BM-EPC为健康对照组；通过DiL-Ac-LDL摄取及FITC-UEA-I结合实验检测实验组、对照组和健康对照组的BM-EPC数量。利用成管及迁移实验评估3组的BM-EPC功能；分别将实验组和对照组BM-EPC与巨核细胞共培养，利用流式细胞术检测巨核细胞增殖情况。结果 实验组BM-EPC高表达CD34/CD133/CD309；TPO可促进BM-EPC增殖，最佳作用浓度为100 μg/L。免疫荧光双标实验显示，实验组BM-EPC数量较对照组明显增加（P<0.05）。实验组成管能力及迁移能力较对照组增强（P<0.05）。共培养后，实验组巨核细胞数多于对照组（P=0.013）。结论 大剂量化疗后患者BM-EPC受损，TPO具有直接刺激巨核系统造血作用，还可能通过促进BM-EPC增殖，修复其功能，从而恢复BM-EPC对巨核细胞的造血支持作用。     

L203对大鼠巨核细胞培养的影响

目的了解TPO模拟肽L203对骨髓抑制后大鼠的促血小板生成作用及对大鼠巨核细胞分化、增殖的影响.方法应用化疗药物卡铂造成大鼠骨髓抑制模型血小板下降到接近零时,开始应用L203、IL-3、IL-11、生理盐水腹腔注射,隔天1次,共用7次.血小板回升后全部动物活杀,然后分离提取大鼠股骨髓有核细胞,分别采用甲基纤维素法及琼脂法进行巨核细胞培养与诱导分化实验.结果L203组巨核细胞集落数明显多于其它组,几组在统计学上差别明显著(P＜0.01).结论L203具有类似TPO的促进巨核细胞增殖分化、增加血小板产生的作用.     

B7-CD28共刺激途径与慢性血小板减少性紫癜关系的探讨

目的　探讨B7 CD2 8共刺激途径与慢性血小板减少性紫癜 (CITP)发病的关系。方法　①应用流式细胞术 ,检测CITP的CD80 /CD2 8的表达水平 ;②通过巨核细胞体外培养观察CITP的巨核细胞生长和成熟 ,并观察CD80单抗对其的影响。结果　①CD80在CITP的B淋巴细胞有较高表达率 ,与对照组比较 (P <0 0 1) ,与SLE比较 (P >0 0 5 )。CITP的CD2 8表达与对照组比较 (P >0 0 5 ) ;②CITP各种集落数均低于对照组 (P <0 0 5 ) ,加入CD80单抗的CITP的巨核细胞集落生成数明显增多 (P <0 0 5 )。结论　CD80在CITP的表达增高及CD80单抗对CITP巨核祖细胞增殖能力的影响 ,均提示协同刺激因子异常可能与CITP发病有关。     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

The Effect of Costimulatory Factors in the Pathogenesis of Chronic Idiopathic Thrombocytopenic Purpura

Chronicidiopathicthrombocytopenicpurpura(CITP )isanorgan specificautoimmunedisordermanifestedbybleeding .AutoantibodiesagainstplateletsurfaceglycoproteinsⅡb/ⅢaandⅠb/Ⅰxre sultinplateletdestructioninreticulo endothelialsys temorplateletlysisbycomplements .Previousre searchmainlyfocusedontheseautoantibodies,whilethecelluarimmunemechanismresultinginthepro ductionofautoantibodiesisnotwellknown .Recentresearchesontheeffectofcostimulatoryfactorsre vealedthattheyarerelatedwithmanyautoimmunedisor…     

CD34~+细胞在急性髓细胞白血病骨髓组织中的表达研究

目的:探讨CD34+细胞在急性髓细胞白血病骨髓组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学染色法,检测急性髓细胞白血病患者初发未治及标准化疗后完全缓解时骨髓组织中CD34+细胞的表达情况。结果:急性髓细胞白血病初发未治组骨髓组织中CD34+细胞阳性表达率与完全缓解组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CD34+细胞与急性髓细胞白血病的发生、发展及预后存在一定关联。     

CD34~+细胞在原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症骨髓组织中的表达

目的:探讨CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症及原发性血小板增多症骨髓组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学染色法,检测原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症实验组及对照组骨髓组织中CD34+细胞表达情况。结果:CD34+细胞在实验组骨髓组织中表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症及原发性血小板增多症骨髓组织中表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症的发生中有一定关系,CD34+细胞与两者之间的转化无必然联系。     

布地奈德对哮喘豚鼠肺和骨髓中0D34、Eotaxin及OOR3表达的影响

目的：探讨布地奈德对哮喘模型鼠骨髓及肺纽织中CD34＋、嗜酸粒细胞趋化因子（Eotaxin）及嗜酸性粒细胞趋化因子受体（CCR3）表达的影响及其治疗哮喘的可能机制。方法：健康雄性豚鼠30只随机分成对照组（A组）、哮喘组（B组）及布地奈德治疗组（C组）,每组10只。B、C组以卵白蛋白（OVA）作为抗原腹腔内注射联合雾化吸入复制哮喘模型,末次激发后6h处死豚鼠,制备豚鼠肺组织病理标本和骨髓标本,苏木精一伊红（HE）染色观察肺组织炎症改变;免疫组化检测CD34＋祖细胞、：）taxin及CCR3在肺组织中的表达。结果：哮喘组肺组织cD34＋祖细胞、Eotaxin及CCR3的阳性细胞数明显增加;布地奈德治疗组肺组织中CD34＋祖细胞、Eotaxin及CCR3的表达均有不同程度的减轻,与哮喘纽比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论：布地奈德可通过下调骨髓及肺组织中cD34＋祖细胞、Eotaxin及CCR3的表达水平,发挥其抗气道炎症的作用。