小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.     

人H5N1流感病毒M1基因的亚克隆及其在原核细胞的表达

目的 构建人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005 M1蛋白的原核表达系统,为进一步研究M1蛋白的生物学功能和制备其诊断试剂奠定基础。方法 以该病毒基因节段七cDNA为模板,PCR扩增得到M1基因片段。将该片段亚克隆至载体pQE80-L中,构建重组质粒pQE80-L/M1,转化大肠埃希菌BL21（ DE3）。IPTG诱导重组蛋白表达。金属镍离子螯合层析纯化N末端携带多聚组氨酸标签的重组M1蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 获得了重组M1蛋白,能与抗H5N1亚型流感病毒血清发生特异性结合,且其免疫后能诱导机体产生特异性抗体。结论 成功获得了人H5N1亚型禽流感病毒M1蛋白在原核细胞中高效表达。     

HIV-1 C亚型Gp120蛋白表达、纯化及其抗体制备的研究

目的 制备HIV-1 C亚型Gp120蛋白及其抗体.方法 用PCR技术从表达C亚型HIV-1全长gp16O基因的质粒上扩增gP120基因羧基末端部分片段,其长度为612个核苷酸,编码204个氨基酸.将测序鉴定正确的gp120基因片段克隆到原核表达载体pET-30a上,以包涵体的形式在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,Gp120蛋白C端融合6×His标签便于纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备C亚型Gp120特异性兔多克隆抗体,用间接ELISA法测定抗体滴度,并用Western Blot方法验证该抗体是否可识别在哺乳动物细胞内表达的C亚型Gp160蛋白.结果 成功地获得高纯度的C亚型Gp120融合蛋白,用其制备的多克隆抗体滴度可达1:204 800,该抗体可特异性识别在COS-1细胞中瞬时表达的C亚型Gp160蛋白.结论 获得了高纯度的C亚型Gp120融合蛋白及其高效价的抗体.     

结核分枝杆菌ClpP1重组蛋白的特性探讨及初步应用

目的用纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)ClpP1重组蛋白免疫新西兰白兔制备ClpP1多克隆抗体并检测其效价,间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性,以初步评价其应用价值。方法通过SDS-PAGE确定ClpP1重组蛋白的主要表达形式,利用纯化包涵体方式对重组蛋白进行纯化;将纯化蛋白免疫新西兰白兔制备ClpP1多克隆抗体并检测其效价;再分别以纯化蛋白为抗原,制备抗体为一抗,间接ELISA法检测临床诊断结核病患者血清中抗M.tb抗体和M.tb抗原。结果 SDSPAGE显示ClpP1重组蛋白主要以包涵体表达形式存在,将纯化蛋白免疫新西兰白兔4次,取血测抗体效价为1∶64 000;Western blot结果显示制备抗体可较好的与ClpP1蛋白特异性结合;间接ELISA法结果表明,以重组蛋白为抗原测患者血清中抗M.tb抗体和以制备抗体为一抗测血清中的M.tb抗原的2实验组分别与对照组相比均具有显著性差异。结论制备了具有免疫原性的M.tb ClpP1重组蛋白及效价较高的多克隆抗体,并得出ClpP1多克隆抗体具有较好的免疫反应性,为进一步研究ClpP1重组蛋白的特性及其应用奠定了基础。     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

Colgalt2-酶联免疫试剂盒的制备

目的 利用N末端Colgalt2多克隆抗体和C末端Colgalt2多克隆抗体,制备Colgalt2双抗体夹心酶联免疫试剂盒.方法 体外扩增Colgalt2的N-末端编码序列,构建其原核表达质粒,诱导纯化Colgalt2重组蛋白.免疫大耳白兔获得抗Colgalt2 N-末端重组蛋白的多克隆抗体.以Colgalt2 N-末端重组蛋白为抗原,利用ELISA和Western Blot技术检测多克隆抗体效价和特异性.以Colgalt2 N-末端多克隆抗体包被酶标板,同时利用HRP标记的C末端Colgalt2抗体,制备Colgalt2-ElISA试剂盒.结果 我们成功克隆表达了N末端Colgalt2基因片段,制备了兔抗Colgalt2多克隆抗体,ELISA分析表明该抗体效价较高（＞1∶1 280000）,Western Blot分析显示该抗体有良好的特异性.对我们所制备的不同浓度的Colgalt2重组蛋白进行分析显示,所制备的分析试剂盒,在1.25～25 μg/ml范围内具有较好分析线性.线性相关系数约为0.98.结论 所制备的Colgalt2-ELISA分析试剂盒可以用于标本内Colgalt2蛋白检测.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。     

釉成熟蛋白Amelotin抗体的制备和初步鉴定

目的:表达并纯化小鼠釉成熟蛋白(Amelotin), 制备多克隆抗体, 并进行初步鉴定.方法:RT-PCR获得Amelotin成熟肽片段, 构建pET32a-Amelotin, IPTG诱导表达Amelotin, 纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, ELISA检测抗体滴度.Western blot和免疫组织化学鉴定抗体特异性.结果:成功构建了Amelotin重组表达载体pET32a-Amelotin,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔, 得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可以达到1:12 800.Western blot分析表明该抗体能特异结合Amelotin, 免疫组化分析表明自制的抗体能特异的与Amelotin相互作用.结论:以纯化的Amelotin为免疫原, 成功地制备了效价及特异性较高的兔抗Amelotin抗体,为进一步建立简便的Amelotin检测方法及研究Amelotin生物学功能奠定了良好的基础.     

抗PIP5KL1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:构建人4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶(phos-Dhatidylinosito1-4-phosphate 5-kinases-like 1,PIP5KL1)质粒并在大肠杆菌中表达,纯化得到相对分子质量(Mr)为42 000的融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备兔抗PIP5KL1多克隆抗体.方法:采用PCR的方法获得编码人PIP5KL1的cDNA序列,将其克隆入pET-32a,构建pET32a-PIP5KL1表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导下表达6×His-融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗人PIP5KL1血清,以Western blot和ELISA方法分析其特异性和效价.结果:PIP5KL1融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,West-em blot结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1:100 000.结论:获得了纯化的PIPSKL1融合蛋白和anti-PIP5KL1多抗血清,为今后对新基因PIP5KL1功能研究打下了基础.     

中青年头晕与颈椎曲度异常的相关性

目的 探讨中青年患者头晕与颈椎生理曲度改变的相关性。 方法 收集2016年6月～2017年3月于新乡医学院第三附属医院神经内科住院治疗的中青年头晕患者，共78例，其中男性32例，女性46例。对所有患者拍摄颈椎4位片，根据Borden测量法将所有患者分为颈椎曲度正常组（n=22例）与颈椎曲度异常组（n=56例），分析两组之间的临床特点，探讨颈椎曲度改变与头晕不同分型的相关性。 结果 颈曲异常组患者入院ABCD2评分、头晕临床症状显著高于颈曲正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。颈椎曲度异常与不同头晕分型之间具有高度正相关（P＜0.01）。 结论 随着患病时间的延长，颈椎生理曲度改变的加重，中青年头晕的临床症状也越来越严重。     

颈椎椎间孔外口区韧带的解剖学观测

目的　对颈椎C_2~7椎间孔外口区域的韧带进行解剖学描述并探讨其临床意义。 方法　对10具成人尸体标本的 100个椎间孔进行解剖观测。鉴别所有出现的韧带,观察并记录C2~7椎间孔外口区域椎间孔外韧带的数量、形态、分布和起止位置。并用游标卡尺分别测量每条韧带的长度、宽度和厚度。 结果　在100个椎间孔外口区域共发现252个椎间孔外韧带。椎间孔外韧带可以分为放射型韧带236 个(93.7 %)和横跨型韧带16个(6.3 %)两种。放射型韧带将神经根连接到周围结构,可分为上方韧带（25.0%）,下方韧带（60.2%）,前方韧带（6.3%）和后方韧带（8.5%）;横跨型韧带与神经根相垂直并横跨于神经根上,其中,横跨型韧带在C4~5节段最为常见,在C4~5节段的平均长度为横跨型韧带长度为(8.12±1.38) mm(6.28~9.93 mm),厚度最厚可达1.04 mm,每个颈椎椎间孔最多只有一条横跨型韧带。 结论　椎间孔外韧带是椎间孔正常的生理结构,可能与颈椎减压术后C5神经麻痹的发生有关。在颈椎减压术后,横跨型韧带可能是造成神经根卡压而引起神经损伤的潜在原因之一。而放射型韧带可以限制脊神经移位,可能因此牵拉神经引起损伤。     

基于MATLAB视网膜视锥细胞的图像处理

背景：视网膜自适应光学成像系统所获取的视锥细胞图像具有灰度分布相对集中、亮点边缘比较模糊、存在伪轮廓及边缘相粘连的特点,寻找一种适合视锥细胞图像的处理算法来获取视网膜视锥细胞清晰轮廓成为今后工作的重点内容。 目的：采用MATLAB图像处理工具箱对视锥细胞图像进行边缘提取,获取其清晰的边缘轮廓。 方法：对30例正常受试者不同部位视锥细胞图像进行预处理、边缘提取和形态学处理,获取视锥细胞图像清晰的边缘轮廓;对处理后的图像进行细胞计数,并分析视锥细胞密度分布特性,进而来验证图像处理算法应用于视锥细胞分布特性研究的可行性。 结果与结论：获取了清晰的视网膜视锥细胞图像轮廓;从结果来看,随着远离黄斑中心凹,细胞密度呈现出降低的趋势,从黄斑中心凹偏0.5°到1°范围内,视网膜视锥细胞密度下降最快。结果提示：实验所设计的图像处理算法在研究视网膜视锥细胞分布特性方面是可行的。     

小腿后外侧穿支皮支链的解剖学研究

目的　探讨小腿后外侧穿支皮支链形成的具体区域，为临床切取小腿后外侧穿支皮支链皮瓣提供解剖学基础。 方法　新鲜成人尸体下肢标本15侧，（女性2侧，男性13侧），皮肤无外伤及手术史。13侧下肢经股动脉行红色乳胶灌注，手术显微镜下进行精细解剖，充分显示各穿支间的链状吻合，并于穿深筋膜处测量各穿支的外径。2侧下肢制做血管铸型标本，观察皮支链的构筑。 结果　小腿后外侧穿支数为67支，每侧(5.15±1.86)支，穿深筋膜处的直径为（0.92±0.25）mm；腓骨长度为（34.78±17.78）cm，参与构成小腿后外侧皮支链的穿支数为34支，每侧为（3.31±1.65）支，直径为（0.99±0.23）mm，占所在区域穿支的（28.33±17.79）%～(64.04±19.48) %。 结论　根据小腿后外侧穿支皮支链分布规律和形式切取皮瓣，不但可适当扩大皮瓣的切取面积，也使皮瓣的血供更加安全。     

不同手术方式治疗踝关节韧带复合体损伤的生物力学评价

目的　研究不同手术方式治疗踝关节3个韧带复合体同时损伤的生物力学特征。 方法　选用6例成年新鲜正常踝关节,建立3组模型：A组：模拟内、外侧韧带损伤后予以形态和张力完全修复,下胫腓联合不固定。B组：模拟内、外侧韧带损伤后予以形态和张力完全修复,固定下胫腓联合。C组：模拟踝关节外侧韧带损伤后予以形态和张力完全修复,固定下胫腓联合,内侧韧带损伤不修复。 6例踝关节按A 、B、C顺序分别入组,分别在背伸10°等5种状态下加载压力,记录和比较各组标本的峰值压力。 结果　各状态下应力比较：B组＜C组＜A组;B组与A组比较均有统计学差异（P＜0.05）;B组与C组比较在背伸、外翻位有统计学差异（P＜0.05）,在其他位置无统计学差异。 结论　当踝关节3个韧带复合体同时损伤时,内、外侧韧带同时完好（或修复）,并且固定下胫腓联合的手术方式能使踝关节应力减至最低。     

三维有限元法分析腰骶区椎间融合联合置入棘突间动态内固定装置后腰椎的生物力学变化

文题释义： Topping-off技术：在融合节段的相邻节段置入棘突间动态内固定装置,以期望达到保护相邻节段目的的一种手术方式。 腰骶区：腰椎与骨盆环相连的区域,即L5/S1节段,应力集中,腰椎节段中活动度最大,融合后对腰椎影响最大。 背景：Topping-off技术通过将腰椎融合和棘突间动态内固定系统(Coflex)结合,在实现充分减压的同时也能够对相邻节段予以保护。目前将Topping-off技术应用于腰骶区需要融合同时相邻节段存在退变的年轻患者的相关力学研究尚未见报道。 目的：建立腰骶交界区Topping-off有限元模型,分析邻近节段生物力学及全腰椎活动度的变化趋势。 方法：随机选择1名健康年轻男性志愿者,既往无腰部外伤史及腰痛病史,经签署志愿同意书后,行薄层CT扫描,获取影像学资料。将图像信息导入计算机,依次通过Mimics、Geomagic Studio 12.0、HyperMesh、Abaqus对图像信息进行分析建立全腰椎模型,即健康组模型。验证模型的有效性后,在健康组模型的基础上改变L₄-S₁椎间盘材料属性建立椎间盘中度退变模型,并在退变模型的基础上分别建立融合模型和Topping-off 模型。然后分别计算4组模型在施加400 N的预载荷和10 N•m的扭转力矩后L₂-L₅节段活动度变化趋势及L₄/L₅椎间盘、髓核以及关节突关节的应力变化。 结果与结论：①Topping-off模型与融合模型腰椎活动度较退变模型减小,且Topping-off模型比融合模型减小更明显;②融合模型术后L₄-L₅活动度较退变模型显著增加,L₂/L₃、L₃/L₄节段活动度相比退变模型并无明显改变;Topping-off模型L₄-L₅活动度较退变模型减小,L₂/L₃、L₃/L₄节段活动度相比退变模型在前屈及后伸体位下均有一定程度增加;③相比退变模型,融合模型L₄-L₅节段在前屈、后伸、左旋、左侧弯4个体位下,椎间盘、髓核、关节突关节应力均增大,而Topping-off模型纤维应力在4个体位下均降低;④说明Topping-off技术不仅能够降低上位相邻节段椎间盘、髓核和关节突的关节应力,而且能够减少相邻节段过度活动,增加上位其他节段的活动度,进而在代偿腰椎活动度的同时延缓相邻节段退变。 ORCID: 0000-0002-5167-9151(曹亮亮) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节;骨植入物;脊柱;骨折;内固定;数字化骨科;组织工程     

骨质疏松症治疗中的运动疗法

背景：骨质疏松症是以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征,以致骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身骨病,通常治疗的首要手段为药物治疗。而单纯药物治疗无法提高肌肉力量,改善平衡功能,进而预防跌倒的发生,因此已不能满足骨质疏松症的综合管理。运动作为一种重要的非药物治疗手段,在骨质疏松症的预防中公认应作为首选,在骨质疏松症的治疗中的重要性逐渐被认识。 目的：结合最新的一些研究文献,探讨运动在骨质疏松症治疗中的作用。 方法：以“骨质疏松症,骨密度,骨强度,治疗,运动,应力,太极,肌肉,骨组织构建”为中文检索词,以“osteoporosis,bone mineral density, bone strength, treatment,exercise,stress,tai chi,muscle,bone architecture”为英文检索词,检索中国知网(CNKI)期刊全文数据库和Medline 2001年1月至2013年2月有关不同运动类型对人骨强度的影响特别是对骨质疏松症患者的治疗作用的临床报道及机制研究。排除重复性研究和不典型报道。 结果与结论：治疗性运动包括有氧运动、抗阻运动、冲击性运动、振动运动等类型,可以安全的提高骨强度,提高肌肉力量,改善平衡功能,预防跌倒和骨折。对于脊柱畸形者适当选用矫形器可提高安全性、促进运动治疗。与药物治疗一样,运动治疗也遵循个体化原则,在良好的依从性和安全性条件下进行运动方案的选择,各种运动的效果均较小,包含高应变速率的运动似乎更有效,但均需要长期坚持运动以维持疗效。     

中晚期孕期束缚应激对子代下丘脑多巴胺能神经元发育的影响

目的　研究中晚期孕期束缚应激对子代下丘脑多巴胺能神经元发育的影响。 方法　使用怀孕SD大鼠,实验组在孕期第15~21 d进行束缚应激,对照组则不受任何干扰。子代大鼠出生的当天为出生后的第0 天。在子代大鼠出生后的第1天（P1）,第7天（P7）和第30天（P30）,分别测子代大鼠的体重,通过免疫组织化学染色和Western Blotting,观察和比较下丘脑内合成多巴胺的关键酶酪氨酸羟化酶（TH）染色像素密度及TH蛋白水平变化。 结果　与正常对照组相比,中晚期孕期束缚应激子代大鼠在P1体重较低,下丘脑TH染色像素密度和TH蛋白水平上调, 这种异常在P7和P30消失。 结论　孕期应激使子代下丘脑多巴胺神经元早期发育异常, 可能是造成子代神经系统行为学异常的原因之一。     

Immunopathogenesis of reactive arthritis:Role of the cytokines

Reactive arthritis(Re A), also known as sterile postinfectious arthritis, belongs to the group of related arthropathies known as spondyloarthritis(SpA). ReA can arise 1-4 wk after a gastrointestinal or genitourinary infection, but once arthritis develops, the microorganism is not found in the joint. The classical microbes associated with ReA development include Gram-negative aerobic or microaerophilic bacteria containing LPS in their outer membrane. The immunopathogenic mechanisms involved in ReA development are still unknown. A hypothesis suggested that the bacteria probably persist outside the joint, at sites such as gut mucosa or lymph nodes, and bacterial antigens might then be transported to the joints. On the other hand, an altered immune response and the unbalanced production of cytokines have been reported in subjects with ReA. Cur-rently, there is increased evidence to suggest that both mechanisms would operate in the immunopathogenesis of ReA. In this review we highlight recent advances on the role of cytokines in the ReA. Particularly, we discuss the roles of some pro- and anti-inflammatory cytokines involved in the immunopathogenesis of ReA.     

近视眼球壁的异常改变及其分子机制研究进展

近年来患有近视的人不断增多。 由于近视严重的并发症及发生逐渐低龄化, 其已成为我国重点 关注的问题。 多项研究显示, 随着近视的进展, 眼球壁会产生一些异常改变。 文章就近视眼球壁的异常改 变及其细胞分子机制进行综述, 为进一步研究近视发病机制和近视防控提供依据。