阿霉素作为G-四联体配体对Tca8113细胞影响的研究

目的：观察阿霉素作为G-四联体配体对Tca8113细胞端粒酶活性、增殖及凋亡的影响，探讨G-四联体结构生物学功能。方法：通过TRAP法和改良TRAP—G4法，分析阿霉素对Ra8113细胞端粒酶介导的端粒延伸反应的影响。研究分2个实验组进行，用药组培养液含2．5μmol几阿霉素，非用药组培养液加相应体积生理盐水，细胞培养1、3、5和7d后．利用TRAP法检测其端粒酶活性；流式细胞仪分析其细胞周期和凋亡率，并对2实验组间凋亡率进行t检验；Giemsa染色和SA—β—gal染色观察凋亡和衰老细胞。结果：TRAP和改良TRAP—G4检测表明，阿霉素通过诱导G4形成抑制Tca8113细胞端粒酶介导的端粒延伸反应。在2．5μmol／L阿霉素作用下，Tca8113细胞端粒酶活性在3d后出现降低：用药组细胞增殖受抑制，停滞于G0—G1期和S期；所有观察期内2实验组间细胞凋亡率差异有统计学意义（P〈0．05）：用药组出现衰老和凋亡细胞。结论：阿霉素诱导G-四联体形成，可抑制Tca8113细胞端粒酶活性，降低其增殖活性．促进衰老和凋亡发生。     

阿霉素诱导鸟嘌呤-四联体形成对Tca8113细胞端粒酶及细胞周期的影响

目的：探讨阿霉素影响端粒酶活性、端粒酶mRNA表达、细胞周期及周期蛋白表达的分子作用机制。方法：采用端粒重复序列扩增法（TRAP）、改良TRAP—G4法和RT—PCR法检测Tca8113细胞端粒酶活性变化、端粒酶hTERT和TP1mRNA水平；流式细胞仪分析细胞周期；采用Western印迹法测定CyclinB1和CyclinA表达水平。采用SPSS10．0软件包对数据进行t检验。结果：所有实验浓度阿霉素均可降低Tca8113细胞端粒酶活性．当端粒酶作用底物变为5＇-（GGGATr），GGGTT-3’时，端粒延伸反应完全受到抑制；5μg/ml阿霉素作用24h后，hTERT和TP1mRNA表达降低，CyclinB1表达明显增强，G2／M期细胞百分率显著下降。结论：阿霉素抑制端粒酶活性、降低端粒酶表达、影响细胞周期及CyclinB1表达的作用机制与其诱导鸟嘌呤-四联体形成有关。     

阿霉素对Tca8113细胞端粒酶活性及端粒结合蛋白表达的影响

目的 观察阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡对端粒酶活性及端粒结合蛋白(TRF)表达的影响;探讨端粒酶和TRF在细胞凋亡途径中的作用机制.方法 通过Tca8113细胞MTT实验,确定后续实验中阿霉素作用浓度.将Tca8113培养细胞分成用药组和对照组,培养5 d和7 d后,利用流式细胞仪检测细胞凋亡;采用Giemsa 染色进行凋亡形态学观察;通过端粒酶酶联免疫吸附实验对端粒酶活性进行定性和定量分析;利用免疫组化和免疫荧光标记法分别检测TRF表达和表达水平.结果 5 μg/ml阿霉素作为后续研究的作用浓度.在5 μg/ml阿霉素作用5 d和7 d后,用药组细胞凋亡率分别为(36.4±1.7)%和(54.2±2.1)%,与对照组比较差异有统计学意义(P ＜ 0.05);Giemsa 染色显示用药组出现明显凋亡细胞;TRAP检测结果表明,用药组端粒酶活性降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);端粒酶活性随阿霉素作用时间延长而降低(P ＜ 0.05);用药组与对照组细胞均有TRF表达,在细胞核内呈均匀蓝染状态,而在诱导凋亡细胞核和凋亡小体内呈点状弥散分布,但两组间TRF表达水平差异无统计学意义(P ＞ 0.05).结论 阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡使其细胞内端粒酶活性受抑制,TRF表达特点发生改变,但未改变TRF表达水平.     

阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡对端粒酶及端粒结合蛋白的影响

目的 探讨端粒酶和端粒结合蛋白（TRF）在细胞凋亡过程中的作用机制。方法 甲基噻唑四唑法（MTT）检测阿霉素对舌鳞癌Tca8113细胞的抑制作用。通过姬姆萨染色和流式细胞仪观察和检测5mg／L阿霉素诱导凋亡情况；利用酶联免疫吸附实验分析端粒酶活性；采用免疫组化和免疫荧光标记法观察和检测TRF表达及其水平。结果 5mg／L阿霉素处理Tca8113细胞5d和7d后，出现明显凋亡；端粒酶活性降低呈时间依赖性；TRF在细胞核内表达，其表达水平无统计学意义（P〉0．05）。结论 阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡可降低端粒酶活性，但不改变TRF表达水平。     

岩黄连脱氢卡维丁体外抑制Tca8113增殖及对端粒酶活性影响的研究

目的：研究中草药岩黄连脱氢卡维丁（Tetradehydroscoulerine，YHL－1）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用，及其对端粒酶活性和端粒酶催化亚基（hTERT）表达的影响，探讨其抗癌机制。方法：采用噻唑蓝比色法（MTT法）检测不同浓度的YHL-1对Tca8113细胞增殖的影响，同时以TRAP—ELISA法检测Tca8113细胞端粒酶活性改变情况，并用Western blotting法半定量检测端粒酶hTERT的表达。结果：YHL-1能明显抑制Tca8113细胞增殖，且随时间延长和药物浓度的增高，抑制作用增强。72h时，0．200、0．100、0．050、0．025 g／LYHL-1组细胞增殖抑制率分别为（64．1±1．5）％、（47．3±3．3）％、（35．6±5．0）％、（31．8±5．87）％。72 h时，0．100、0．050 g／L组端粒酶活性和hTERT蛋白含量均低于空白对照组（P〈0．05）。结论：岩黄连脱氢卡维丁可以明显抑制Tca8113细胞的增殖，并显著降低其端粒酶活性及hTERT的表达，这可能是其抗舌癌的机制之一。     

放射线对舌鳞癌细胞端粒酶活性的影响

目的：端粒酶活性存在于人类几乎所有永生细胞株中,放射治疗仍是目前口腔癌综合治疗的重要组成部分,本研究旨在探讨X线对人舌鳞状细胞癌系Tca8113细胞端粒酶活性的影响。方法：体外培养的人舌鳞癌细胞系Tca8113经0、2、4、8、12、20Gy剂量X线照射,于照射后0．5h、1h、3h、5h收集细胞,采用TRAP法检测不同剂量X线照射前后Tca8113细胞中端粒酶活性。结果：未经X线照射时,Tca8113细胞呈端粒酶阳性,照射后仅2Gy组存在端粒酶活性,其它各照射剂量组细胞均呈端粒酶阴性。结论：人舌鳞癌细胞系Tca8113是端粒酶阳性细胞系,端粒酶活性是Tca8113细胞经放射线照射后赖以生存的重要因素;Tca8113细胞的端粒酶活性具有放射剂量依赖性,经X线照射后,端粒酶活性显著下调;2Gy是体外Tca8113细胞能够耐受的单次照射剂量。     

β-胡萝卜素对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的 观察β-胡萝卜素对体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞的细胞毒性、细胞周期、细胞凋亡以及端粒酶活性的影响.方法 四唑蓝法检测30、 50、 60和70 μmol/L 4种浓度β-胡萝卜素对Tca8113细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪观察β-胡萝卜素处理后Tca8113细胞周期改变及细胞凋亡,端粒重复片段扩增银染法检测细胞端粒酶活性的变化.结果 从50 μmol/L开始,随β-胡萝卜素浓度的提高,对Tca8113细胞增殖抑制作用越来越强.70 μmol/L β-胡萝卜素作用Tca8113细胞4 d后,抑制率超过50%,细胞生长曲线的"S"形趋于平缓.70 μmol/L β-胡萝卜素作用Tca8113细胞3 d后,流式细胞仪检测未出现亚二倍体的"凋亡峰".与空白对照组相比,实验组S期细胞减少约50%(P<0.05),G0/G1期细胞同时显著增加(P<0.05),G2/M期细胞变化无统计学意义(P>0.05).β-胡萝卜素处理Tca8113细胞后,端粒酶活性显著下调.结论 β-胡萝卜素可以通过减少DNA合成,阻滞细胞于G0/G1期,抑制舌癌Tca8113细胞的增殖,抑制效果随浓度的增加而明显.作用机制可能与下调肿瘤细胞端粒酶活性、导致细胞死亡有关.     

端粒酶RNA反义寡核苷酸对舌癌细胞系Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的探讨端粒酶RNA反义寡核苷酸对舌癌细胞系Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响。方法反义寡核苷酸(AS-ONS)作用于Tca8113细胞;采用MTT法测定AS-ONS对Tca8113细胞的毒性;倒置相差显微镜观察细胞生长状况及形态学改变;透射电镜观察细胞超微结构;测定Tca8113细胞端粒酶活性。结果AS-ONS可明显地抑制Tca8113细胞的生长,其生长抑制随剂量的增加而增强,具有浓度依赖性;AS-ONS对于Tca8113细胞端粒酶活性抑制作用具有时间依赖性。不同浓度AS-ONS作用于Tca8113细胞,其细胞毒性作用较弱;在倒置显微镜下可见AS-ONS组随药物浓度增高,细胞生长出现抑制。透射电镜观察到AS-ONS组作用的细胞细胞膜破损,细胞核内染色质凝聚,边集,并穿过核膜溢入胞质中,胞质部分溶解,线粒体空胞变性;AS-ONS对端粒酶活性抑制效果非常明显。结论反义寡核苷酸AS-ONS可明显地抑制Tca8113细胞的生长,并具有剂量依赖性和时间依赖性;靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸可明显地抑制Tca8113细胞端粒酶活性,细胞增殖受到明显抑制。     

钾离子通道阻滞剂4-AP 对人舌鳞癌 Tca8113细胞增殖的影响

目的：检测4-氨基啶（4-AP）对 Tca8113细胞株增殖的影响。方法：采用 CCK-8法检测不同浓度4-AP 作用于 Tca8113细胞株12、24、48 h 后对细胞的增殖抑制率;流式细胞术（FCM）检测各组细胞周期变化。采用 SPSS19．0软件对数据进行统计学分析。结果：随着4-AP 浓度的增加和干预时间的延长,Tca8113细胞形态发生改变。在浓度5～100 mmol／L 范围内作用于细胞12～48 h,4-AP 浓度和时间依赖性地抑制了 Tca8113细胞的增殖（P ＜0．01）。不同浓度4-AP 作用于 Tca8113细胞株24 h后,G0／G1期的细胞所占的比例显著升高（P ＜0．01）;S 期细胞所占的比例显著降低（P ＜0．01）;4-AP 阻滞 Tca8113细胞株于G0／G1期。结论：4-AP 可能通过调控细胞周期抑制 Tca8113细胞株的增殖对细胞株分布有影响。     

醋酸棉酚对人舌鳞癌Tca8113细胞生长及人类错配修复基因1甲基化水平的影响

目的 研究醋酸棉酚（ GAA）对人舌鳞癌 Tca8113细胞增殖的影响和对人类错配修复基因 1（hMLH1）甲基化水平的影响,初步探讨其抗肿瘤机理。方法 应用 MTT法检测 GAA对Tca8113细胞生长的影响;应用巢式甲基化特异性聚合酶链反应（nMSP）检测 Tca8113细胞在 GAA作用 48、72 h后hMLH1基因甲基化状态的改变情况。结果 MTT检测显示,作用 24~72 h,GAA对Tca8113细胞生长具有抑制作用;nMSP检测显示,以终浓度 30、15 μmol•L-1的GAA作用于 Tca8113细胞 48、72 h后, hMLH1基因甲基化条带的平均光度值降低,与未经药物处理组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 GAA能抑制舌鳞癌细胞的生长,并能降低 hMLH1基因的甲基化水平。 GAA去甲基化作用可能是其具有抗肿瘤作用的机制之一。     

4，5，7-三羟基异黄酮和阿霉素诱导人舌癌细胞株Tea8113凋亡的研究

目的观察4,5,7-三羟基异黄酮（Genistein）和阿霉素（ADM）单用和联用对诱导体外培养的人舌癌细胞株rrca8113凋亡的影响。方法以体外培养的人舌癌细胞株Tca8113为实验模型,Genistein与ADM联合作用于癌细胞,倒置相差显微镜下观察药物处理后癌细胞的细胞形态学变化,四甲基偶氮唑蓝比色法分析药物对癌细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期分布。结果Genistein和ADM两者单用对癌细胞均有生长抑制作用,且随剂量升高抑制趋势增强（P〈0．05）。两药联用对癌细胞的抑制作用优于两者的单纯相加（Q〉1）。联合用药使肿瘤细胞S期延长,G2／G1值缩小,凋亡率明显升高（P〈0．05）。结论Genistein与ADM联用对Tca8113细胞具有协同抑制作用,其作用机理可能是联合用药促使肿瘤细胞S期延长,G2／G1值缩小,提高了ADM的诱导凋亡效应。     

岩黄连总碱抑制Tca8113细胞及其端粒酶活性的实验研究

目的:研究中草药岩黄连总碱(yanhuanglian total alkalions,YHL-TA)对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响及其抗癌机制。方法:采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测YHL-TA浓度分别为0.200、0.100、0.050、0.025g/L和空白对照组Tca-8113细胞增殖的情况,同时用以PCR为基础的TRAP-ELISA法检测Tca8113细胞端粒酶活性的改变。所有数据采用SPSS13.0进行统计学分析。结果:岩黄连总碱能明显抑制Tca8113细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。72h时,0.200、0.100、0.050、0.025g/L岩黄连总碱组细胞增殖抑制率分别为(66.0±4.0)%、(57.5±3.2)%、(45.3±3.3)%、(37.9±5.5)%。72h时,0.100、0.050g/L组端粒酶活性低于空白对照组(P<0.05)。结论:岩黄连总碱可以明显抑制Tca8113细胞株的增殖及其端粒酶活性,抑制端粒酶活性可能是岩黄连总碱抗舌癌的机制之一。     

4,5,7-三羟基异黄酮和阿霉素诱导人舌癌细胞株Tca8113凋亡的研究

目的观察4,5,7-三羟基异黄酮(Genistein)和阿霉素(ADM)单用和联用对诱导体外培养的人舌癌细胞株Tca8113凋亡的影响。方法以体外培养的人舌癌细胞株Tca8113为实验模型,Genistein与ADM联合作用于癌细胞,倒置相差显微镜下观察药物处理后癌细胞的细胞形态学变化,四甲基偶氮唑蓝比色法分析药物对癌细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期分布。结果Genistein和ADM两者单用对癌细胞均有生长抑制作用,且随剂量升高抑制趋势增强(P<0.05)。两药联用对癌细胞的抑制作用优于两者的单纯相加(Q>1)。联合用药使肿瘤细胞S期延长,G2/G1值缩小,凋亡率明显升高(P<0.05)。结论Genistein与ADM联用对Tca8113细胞具有协同抑制作用,其作用机理可能是联合用药促使肿瘤细胞S期延长,G2/G1值缩小,提高了ADM的诱导凋亡效应。     

SRB法检测As_2O_3对KB细胞和Tca8113细胞毒性的研究

目的:采用SRB(Sulforhodamine B)法研究三氧化二砷(As2O3)对人口腔鳞癌KB细胞和Tca8113的细胞毒性。方法:采用SRB法检测As2O3作用于KB细胞和Tca8113细胞前后的A值变化。结果:SRB法检测结果显示在KB组,1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4μg/mL质量浓度的As2O3所对应的A值分别为0.11、0.21、0.26、0.27、0.27;在Tca8113组,1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4μg/mL质量浓度的As2O3对应的A值分别为0.48、0.81、0.93、0.97、0.97。结论:As2O3对人口腔鳞癌KB细胞和Tca8113细胞的增殖有明显抑制作用,癌细胞抑制率呈现出剂量依赖性效应关系。     

银杏酸对口腔鳞癌多药耐药的影响

目的以卡铂（CBP）和平阳霉素（PYM）为诱导物,构建耐药细胞株Tca8113/CBP和Tca8113/PYM,再通过银杏酸（GAs）与化疗药物联用探讨银杏酸对耐药细胞多药耐药（MDR）的影响。方法免疫组织化学检测P-糖蛋白（P-gp）的表达,MTT法确定耐药细胞的耐药指数;不同质量浓度的GAs作用于耐药细胞及亲本细胞,通过MTT法检测对它们的增殖抑制效应,确定GAs的无细胞毒性质量浓度并观察GAs对耐药细胞的逆转作用;GAs与耐药细胞联用诱导细胞一段时间后,再次通过MTT法检测其耐药指数。结果免疫组织化学结果显示,耐药细胞的P-gp阳性表达率明显高于亲本细胞,MTT法确定GAs的无细胞毒性质量浓度为10 μg·mL-1;GAs对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的逆转倍数分别是2.94和2.43,与GAs联用前Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的耐药指数分别是3.24和11.9,联用后的耐药指数分别是2.18和4.43。结论本实验成功诱导出了耐药细胞株Tca8113/CBP和Tca8113/PYM,并将银杏酸与化疗药物联用,进一步证实了两者的共用能够增强对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的增殖抑制作用,无细胞毒质量浓度的GAs对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的耐药性有部分逆转作用,且共用一段时间后耐药细胞的MDR水平有所下降。     

Tca8113-4-1BBL细胞联合CD28单抗在口腔鳞癌免疫治疗中的作用

目的:探讨转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28单抗体外诱导抗肿瘤活性的能力.方法:通过脂质体法将重组载体pEGFP/neo-h4-1BBL转染人舌鳞癌细胞Tca8113,经G418(400μg/mL)筛选及有限稀释后,获得稳定高表达克隆,分别用RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表达.将转染与未转染4-1BBL基因的Tea8113细胞用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗.联合抗CD28单克隆抗体与经体外抗CD3mAb诱导的人外周血T淋巴细胞共同培养,测定T细胞增殖、CTL杀伤活性及产生细胞因子(IL-2和IFN-γ)的能力.实验数据以SPSS12.0软件包进行方差分析.结果:h4-1BBL基因真核表达载体在Tca8113细胞中获得稳定表达.转染h4-1BBL基因的Tca8113细胞联合抗CD28单抗能显著刺激T细胞活化、增殖(P(0.01),促进IL-2、IFN-γ分泌(P<0.01),并能有效地诱导CTL的特异性杀伤活性(P<0.01).结论:转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28抗体能显著增强肿瘤细胞的免疫原性,诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

ADAM15在舌癌耐药细胞系Tca8113／ADM表达的实验研究

目的研究舌癌阿霉素（adriamycin;ADM）耐药细胞系Tca8113／ADM及其亲本细胞系Tca81t3肿瘤转移相关蛋白去整合素一金属蛋白酶15（adamalysin15,ADAM15）的表达水平,从肿瘤耐药的角度对舌癌的耐药与ADAM15的关系进行初步探讨。方法用蛋白免疫印迹技术检测Tca8113／ADM及Tca8113亲本细胞系的AD-AM15蛋白表达水平。结果ADAM15在Tca8113亲本细胞系和Tea8113／ADM细胞系的表达分别为0．244±0．231和1．217±0．494,两者差异具有统计学意义（P=0．001）。结论肿瘤转移相关蛋白ADAMt5在ToaS113／ADM细胞系的表达高于其在亲本细胞的表达,提示舌癌的阿霉素耐药细胞系的转移一洼可能比其亲本细胞更强。