阿霉素对Tca8113细胞端粒酶活性及端粒结合蛋白表达的影响

目的 观察阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡对端粒酶活性及端粒结合蛋白(TRF)表达的影响;探讨端粒酶和TRF在细胞凋亡途径中的作用机制.方法 通过Tca8113细胞MTT实验,确定后续实验中阿霉素作用浓度.将Tca8113培养细胞分成用药组和对照组,培养5 d和7 d后,利用流式细胞仪检测细胞凋亡;采用Giemsa 染色进行凋亡形态学观察;通过端粒酶酶联免疫吸附实验对端粒酶活性进行定性和定量分析;利用免疫组化和免疫荧光标记法分别检测TRF表达和表达水平.结果 5 μg/ml阿霉素作为后续研究的作用浓度.在5 μg/ml阿霉素作用5 d和7 d后,用药组细胞凋亡率分别为(36.4±1.7)%和(54.2±2.1)%,与对照组比较差异有统计学意义(P ＜ 0.05);Giemsa 染色显示用药组出现明显凋亡细胞;TRAP检测结果表明,用药组端粒酶活性降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);端粒酶活性随阿霉素作用时间延长而降低(P ＜ 0.05);用药组与对照组细胞均有TRF表达,在细胞核内呈均匀蓝染状态,而在诱导凋亡细胞核和凋亡小体内呈点状弥散分布,但两组间TRF表达水平差异无统计学意义(P ＞ 0.05).结论 阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡使其细胞内端粒酶活性受抑制,TRF表达特点发生改变,但未改变TRF表达水平.     

阿霉素作为G-四联体配体对Tca8113细胞影响的研究

目的：观察阿霉素作为G-四联体配体对Tca8113细胞端粒酶活性、增殖及凋亡的影响，探讨G-四联体结构生物学功能。方法：通过TRAP法和改良TRAP—G4法，分析阿霉素对Ra8113细胞端粒酶介导的端粒延伸反应的影响。研究分2个实验组进行，用药组培养液含2．5μmol几阿霉素，非用药组培养液加相应体积生理盐水，细胞培养1、3、5和7d后．利用TRAP法检测其端粒酶活性；流式细胞仪分析其细胞周期和凋亡率，并对2实验组间凋亡率进行t检验；Giemsa染色和SA—β—gal染色观察凋亡和衰老细胞。结果：TRAP和改良TRAP—G4检测表明，阿霉素通过诱导G4形成抑制Tca8113细胞端粒酶介导的端粒延伸反应。在2．5μmol／L阿霉素作用下，Tca8113细胞端粒酶活性在3d后出现降低：用药组细胞增殖受抑制，停滞于G0—G1期和S期；所有观察期内2实验组间细胞凋亡率差异有统计学意义（P〈0．05）：用药组出现衰老和凋亡细胞。结论：阿霉素诱导G-四联体形成，可抑制Tca8113细胞端粒酶活性，降低其增殖活性．促进衰老和凋亡发生。     

阿霉素诱导鸟嘌呤-四联体形成对Tca8113细胞端粒酶及细胞周期的影响

目的：探讨阿霉素影响端粒酶活性、端粒酶mRNA表达、细胞周期及周期蛋白表达的分子作用机制。方法：采用端粒重复序列扩增法（TRAP）、改良TRAP—G4法和RT—PCR法检测Tca8113细胞端粒酶活性变化、端粒酶hTERT和TP1mRNA水平；流式细胞仪分析细胞周期；采用Western印迹法测定CyclinB1和CyclinA表达水平。采用SPSS10．0软件包对数据进行t检验。结果：所有实验浓度阿霉素均可降低Tca8113细胞端粒酶活性．当端粒酶作用底物变为5＇-（GGGATr），GGGTT-3’时，端粒延伸反应完全受到抑制；5μg/ml阿霉素作用24h后，hTERT和TP1mRNA表达降低，CyclinB1表达明显增强，G2／M期细胞百分率显著下降。结论：阿霉素抑制端粒酶活性、降低端粒酶表达、影响细胞周期及CyclinB1表达的作用机制与其诱导鸟嘌呤-四联体形成有关。     

岩黄连脱氢卡维丁体外抑制Tca8113增殖及对端粒酶活性影响的研究

目的：研究中草药岩黄连脱氢卡维丁（Tetradehydroscoulerine，YHL－1）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用，及其对端粒酶活性和端粒酶催化亚基（hTERT）表达的影响，探讨其抗癌机制。方法：采用噻唑蓝比色法（MTT法）检测不同浓度的YHL-1对Tca8113细胞增殖的影响，同时以TRAP—ELISA法检测Tca8113细胞端粒酶活性改变情况，并用Western blotting法半定量检测端粒酶hTERT的表达。结果：YHL-1能明显抑制Tca8113细胞增殖，且随时间延长和药物浓度的增高，抑制作用增强。72h时，0．200、0．100、0．050、0．025 g／LYHL-1组细胞增殖抑制率分别为（64．1±1．5）％、（47．3±3．3）％、（35．6±5．0）％、（31．8±5．87）％。72 h时，0．100、0．050 g／L组端粒酶活性和hTERT蛋白含量均低于空白对照组（P〈0．05）。结论：岩黄连脱氢卡维丁可以明显抑制Tca8113细胞的增殖，并显著降低其端粒酶活性及hTERT的表达，这可能是其抗舌癌的机制之一。     

β-胡萝卜素对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的 观察β-胡萝卜素对体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞的细胞毒性、细胞周期、细胞凋亡以及端粒酶活性的影响.方法 四唑蓝法检测30、 50、 60和70 μmol/L 4种浓度β-胡萝卜素对Tca8113细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪观察β-胡萝卜素处理后Tca8113细胞周期改变及细胞凋亡,端粒重复片段扩增银染法检测细胞端粒酶活性的变化.结果 从50 μmol/L开始,随β-胡萝卜素浓度的提高,对Tca8113细胞增殖抑制作用越来越强.70 μmol/L β-胡萝卜素作用Tca8113细胞4 d后,抑制率超过50%,细胞生长曲线的"S"形趋于平缓.70 μmol/L β-胡萝卜素作用Tca8113细胞3 d后,流式细胞仪检测未出现亚二倍体的"凋亡峰".与空白对照组相比,实验组S期细胞减少约50%(P<0.05),G0/G1期细胞同时显著增加(P<0.05),G2/M期细胞变化无统计学意义(P>0.05).β-胡萝卜素处理Tca8113细胞后,端粒酶活性显著下调.结论 β-胡萝卜素可以通过减少DNA合成,阻滞细胞于G0/G1期,抑制舌癌Tca8113细胞的增殖,抑制效果随浓度的增加而明显.作用机制可能与下调肿瘤细胞端粒酶活性、导致细胞死亡有关.     

Fas基因转染对舌鳞癌细胞系Tca8113凋亡的影响

目的探讨外源性Fas基因介导舌鳞癌细胞凋亡的可行性及其可能的分子机制。方法脂质体法将重组人Fas真核表达载体转染人舌鳞癌细胞系Tca8113，抗Fas单克隆抗体诱导其凋亡，Western blotting检测转染前后Tca8113细胞Fas蛋白表达水平，TUNEL法检测转染前后细胞凋亡水平。结果转染后Tca8113细胞Fas蛋白表达上调；抗Fas单克隆抗体可诱导Tca8113细胞凋亡，凋亡指数升高。结论上调Fas基因表达及应用抗Fas单克隆抗体可诱导肿瘤细胞凋亡，有可能作为肿瘤基因治疗的新途径。     

Survivin基因在顺铂诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡中的作用

目的体外观察顺铂（DDP）诱导Tca8113舌鳞癌细胞株凋亡的作用, 同时检测在此过程中凋亡蛋白抑制因子Survivin mRNA表达和蛋白表达的变化。方法将人Tca8113舌鳞癌细胞株进行传代培养,MTT法检测顺铂不同浓度和不同时间对Tca8113舌鳞癌细胞生长的抑制作用,通过RT- PCR检测凋亡过程中Survivin基因mRNA的表达,免疫细胞化学观察Survivin基因的蛋白表达,以及流式细胞术观察顺铂诱导各组Tca8113细胞的凋亡率。结果顺铂可明显抑制Tca8113舌鳞癌细胞的增殖, 其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性,细胞凋亡率也呈同样的趋势,最高可达34.1%。1.0 μg/mL DDP处理Tca8113舌鳞癌细胞,Survivin mRNA和蛋白表达水平随时间的增加而降低,在24h达到最低,随后又升高。结论抗凋亡蛋白Survivin在Tca8113舌鳞癌细胞高表达,顺铂可有效诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡, Survivin mRNA表达在化疗早期随作用时间的延长而降低,Survivin基因的抑制在顺铂诱导的Tca8113舌鳞癌细胞的细胞凋亡中起着重要的作用。     

阿霉素诱导鸟嘌呤-四链体形成对Tca8113细胞端粒酶介导的端粒延伸反应的影响

目的探讨阿霉素诱导端粒重复序列核苷酸形成G4及其抑制Tca8113细胞端粒酶介导的端粒延伸反应的功能作用。方法通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移实验来分析不同质量浓度的阿霉素对d（TTAGGG）3、d（TTAGGG）4和d（TTAGGG）5迁移速度的影响以及对d（TTAGGG）4、d（TTAGAG）4、d（TTAGGG）5和d（TTAGGGT）电泳的影响;用二甲基硫酸盐（DMS）甲基化保护实验分析d（TTAGGG）4和d（TTAGAG）4中G的甲基化作用;利用经典端粒重复序列扩增法（TRAP）和改良TRAP- G4检测法分析阿霉素抑制Tca8113细胞端粒酶介导的端粒延伸反应的特点。结果质量浓度为5.00 μg/mL阿霉素可使部分线性d（TTAGGG）4和d（TTAGGG）5转变成有二级结构的复合物,呈现为新的高速迁移条带。质量浓度为1.25 μg/mL阿霉素可保护端粒重复序列中G免遭甲基化作用。质量浓度为2.50、1.25 μg/mL阿霉素在TRAP检测中可部分抑制端粒延伸反应,而在TRAP- G4检测中可完全抑制端粒延伸反应。结论阿霉素可通过诱导端粒重复序列形成分子内G4结构抑制端粒酶介导的端粒延伸反应。     

反义端锚聚合酶1逆转录病毒载体的构建及其对舌癌细胞增殖的抑制作用

目的探讨以端锚聚合酶1（TRF1-interacting，ankyrin-relatedADP-ribosepolymerase1，tankyrase-1）为靶点的舌癌基因治疗的可能性。方法将tankyrase-1的cDNA反向插入逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义重组病毒，感染舌癌TCCA-8113细胞。采用RT-PCR法检测tankyrase-1表达，端粒酶重复扩增法检测端粒酶活性，绘制生长曲线，了解细胞生长状态，倒置显微镜观察和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果反义tankyrase-1逆转录病毒载体作用后的舌癌细胞tankyrase-1表达下降，端粒酶活性及细胞生长受到明显抑制，细胞出现凋亡。结论反义tankyrase-1对TCCA-8113细胞的生长和端粒酶活性具有明显的抑制作用，有可能以tankyrase-1为靶点对舌癌进行基因治疗。     

放射诱导启动子介导CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的实验研究

目的 观察人工放射诱导启动子介导CDglyTK双自杀融合基因治疗Tca8113细胞的疗效，为舌鳞癌治疗探索新的途径。方法 构建人工放射诱导启动子调控双融合自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1（+）/E-CDglyTK，用脂质体为载体转染Tca8113细胞后予以3 Gy诱导放疗，描绘细胞生长曲线，RT-PCR检测CDglyTK的表达，流式细胞仪检测细胞的凋亡和增殖。结果 诱导放疗可显著增强双自杀基因CDglyTK对Tca8113细胞的毒性作用；RT-PCR半定量分析诱导放疗增强了CDglyTK基因的mRNA表达；流式细胞检测发现治疗组细胞的凋亡指数明显高于对照组，而增殖指数则低于对照组，诱导放疗显著提升了这种差距。结论 人工合成放射诱导启动子可作为基因治疗中的分子开关调节CDglyTK基因在Tca8113细胞中靶向表达。低剂量放射性照射可显著提高放射诱导启动子调控的CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的疗效。     

维生素E琥珀酸酯诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的研究

目的探讨维生素E琥珀酸酯（VES）对人舌鳞癌Tca8113细胞的凋亡诱导作用及其可能的分子机制。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测VES对舌鳞癌Tca8113细胞的抑制作用;应用流式细胞仪分析不同质量浓度VES处理后舌鳞癌细胞的凋亡率;Fas中和抗体进行阻断实验;以细胞免疫化学法和流式细胞仪检测VES处理后肿瘤细胞Fas蛋白水平和细胞表面Fas表达的变化。结果不同质量浓度的VES处理后,舌鳞癌细胞的生长受到明显的抑制,肿瘤细胞的凋亡率显著上升,呈现时间依赖性和剂量依赖性;Fas中和抗体进行阻断后,细胞凋亡率显著下降;VES处理后细胞Fas蛋白表达增强;流式细胞仪检测细胞表面Fas平均荧光强度也显著升高。结论VES对舌鳞癌细胞具有凋亡诱导作用,其作用机制与肿瘤细胞表面Fas蛋白表达的上调有关。     

岩黄连总碱抑制Tca8113细胞及其端粒酶活性的实验研究

目的:研究中草药岩黄连总碱(yanhuanglian total alkalions,YHL-TA)对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响及其抗癌机制。方法:采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测YHL-TA浓度分别为0.200、0.100、0.050、0.025g/L和空白对照组Tca-8113细胞增殖的情况,同时用以PCR为基础的TRAP-ELISA法检测Tca8113细胞端粒酶活性的改变。所有数据采用SPSS13.0进行统计学分析。结果:岩黄连总碱能明显抑制Tca8113细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。72h时,0.200、0.100、0.050、0.025g/L岩黄连总碱组细胞增殖抑制率分别为(66.0±4.0)%、(57.5±3.2)%、(45.3±3.3)%、(37.9±5.5)%。72h时,0.100、0.050g/L组端粒酶活性低于空白对照组(P<0.05)。结论:岩黄连总碱可以明显抑制Tca8113细胞株的增殖及其端粒酶活性,抑制端粒酶活性可能是岩黄连总碱抗舌癌的机制之一。     

三氧化二砷对舌鳞癌细胞凋亡及端粒酶逆转录酶基因的作用

目的　研究三氧化二砷(As2O3)对舌鳞癌细胞株(Tca8113)增殖的影响及对端粒酶逆转录酶基因(hTERT mRNA)的作用,并初步探讨三氧化二砷的作用机制。方法　以舌鳞癌细胞株(Tca8113)为研究对象,采用噻唑蓝 (MTT)、Annexin V/碘化丙锭(PI)染色法检测细胞生长抑制率和细胞凋亡率;采用Western blot检测细胞hTERT蛋白 的表达;采用RT-PCR法检测细胞hTERTmRNA的表达情况。结果　As2O3能够明显抑制Tca8113细胞增殖,诱导 细胞凋亡,并有浓度、时间依赖性。5μmol/L As2O3组72 h细胞生长抑制率为83·40%±7·31%,细胞凋亡率为 26·40%±3·42%。As2O3能抑制hTERTmRNA的表达和翻译,随As2O3作用时间、浓度增加,细胞hTERTmRNA和蛋 白表达减弱,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0·05)。结论　As2O3可以明显抑制Tca8113细胞增殖, 诱导舌癌细胞凋亡,并抑制端粒酶催化亚基基因的表达,诱导细胞凋亡和抑制hTERT转录和翻译可能是其作用机 制之一。     

PI3K/Akt信号通路抑制剂在舌鳞癌细胞系增殖和凋亡中的作用

目的:探讨PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对舌鳞癌细胞系Tca8113增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法:LY294002处理Tca8113细胞,MTT法观察对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot及ELISA分析LY294002作用前后p-Akt及Akt蛋白的表达。结果:随LY294002浓度(0、10、25、50、75μmol/L)的增加及作用时间(24、48 h)的延长,实验组Tca8113细胞的增殖抑制率逐渐增大,LY294002抑制作用与浓度及作用时间呈正相关LY294002干预细胞24 h后,细胞凋亡率显著高于未干预组,p-Akt蛋白表达明显降低,而总Akt表达无显著改变。结论:LY294002可诱导Tca8113细胞凋亡,其作用机制与抑制PI3K/Akt信号通路的效应分子p-Akt的活化有关。     

核因子-κB传导通路与舌癌细胞平阳霉素化疗敏感性的关系

的 探讨核因子-κB（NF-κB）/p65信号传导通路与Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性的关系。方法 以脂质体为载体,转染2 mg/L的p65反义寡核苷酸于Tca8113细胞 后,8 mg/L的平阳霉素处理细胞,3 h、6 h后免疫组化、Western blot法检测细胞核内p65形态和含量变化,48 h后MTT法检测细胞抑制率。结果 平阳霉素能激活细胞内的NF-κB/p65信号传导通路,而p65反义寡核苷酸转染能明显抑制该信号通路,在6 h时胞核内p65含量显著减少（P<0.05）,48 h时细胞抑制率明显提高（P<0.05）。结论 抑制NF-κB/p65信号传导通路能够提高Tca8113细胞平阳霉素化疗敏感性。     

端粒酶RNA反义寡核苷酸对舌癌细胞系Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的探讨端粒酶RNA反义寡核苷酸对舌癌细胞系Tca8113细胞增殖和端粒酶活性的影响。方法反义寡核苷酸(AS-ONS)作用于Tca8113细胞;采用MTT法测定AS-ONS对Tca8113细胞的毒性;倒置相差显微镜观察细胞生长状况及形态学改变;透射电镜观察细胞超微结构;测定Tca8113细胞端粒酶活性。结果AS-ONS可明显地抑制Tca8113细胞的生长,其生长抑制随剂量的增加而增强,具有浓度依赖性;AS-ONS对于Tca8113细胞端粒酶活性抑制作用具有时间依赖性。不同浓度AS-ONS作用于Tca8113细胞,其细胞毒性作用较弱;在倒置显微镜下可见AS-ONS组随药物浓度增高,细胞生长出现抑制。透射电镜观察到AS-ONS组作用的细胞细胞膜破损,细胞核内染色质凝聚,边集,并穿过核膜溢入胞质中,胞质部分溶解,线粒体空胞变性;AS-ONS对端粒酶活性抑制效果非常明显。结论反义寡核苷酸AS-ONS可明显地抑制Tca8113细胞的生长,并具有剂量依赖性和时间依赖性;靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸可明显地抑制Tca8113细胞端粒酶活性,细胞增殖受到明显抑制。     

塞来昔布对Tca8113细胞环氧化酶-2表达及诱导凋亡的作用

目的观察选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞的生长抑制、COX-2表达调节及诱导凋亡的作用。方法在Tca8113细胞中分别加入含有不同浓度塞来昔布的培养液,培养24、48、72 h后,采用MTT方法测定细胞生长抑制率,采用免疫组化方法观察COX-2蛋白在Tca8113细胞中的表达,应用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学特征,应用Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞的早期凋亡率,相对定量荧光定量PCR检测Tca8113细胞中COX-2 mRNA的表达。结果COX-2蛋白在Tca8113细胞中呈强阳性表达,塞来昔布在抑制细胞生长的同时,抑制Tca8113细胞COX-2蛋白的表达;Tca8113细胞经塞来昔布处理后凋亡细胞多见,与对照组相比,塞来昔布处理组早期凋亡细胞增多有统计学意义;塞来昔布调节COX-2 mRNA表达的作用与对照组相比无统计学意义。结论塞来昔布主要以剂量依赖的方式抑制Tca8113细胞生长,诱导细胞凋亡,其作用与抑制COX-2蛋白表达有关,而对COX-2基因作用较弱,其作用机制有待进一步研究。     

高迁移率族蛋白N2抑制口腔鳞状细胞癌增殖作用的体外研究

目的 以人口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113为实验模型,初步探讨高迁移率族蛋白N2（HMGN2）抗口腔鳞状细胞癌的作用。方法 大量培养重组人HMGN2表达载体大肠杆菌BL21,用异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG） 诱导HMGN2的表达,产物用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit进行纯化。在细胞培养基中加入不同质量浓度的HMGN2,通过MTT、Hoechst 33342荧光染色、流式细胞术和Western-blot法检测其凋亡效果及抗凋亡的分子机制。结果 经MTT检测证明HMGN2能显著抑制Tca8113细胞的生长,通过Hoechst 33342荧光染色、流式细胞术和 Western-blot检测证明HMGN2能使Tca8113的细胞形态发生改变,并且能使Tca8113细胞阻滞于细胞周期的S期,促进Tca8113细胞凋亡。结论 HMGN2可以促进人口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡。