蚯蚓纤溶酶的分离纯化研究

目的从赤子爱胜蚓(Eisenia Foelide)中分离纯化出一种相对分子质量(Mr)较小的纤维蛋白溶解组分———蚯蚓纤溶酶(EFE),为其注射剂的研制开发打下基础。方法采用盐析、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等方法分离纯化EFE,用SDS-PAGE对纯化的活性组分进行Mr测定,用酶谱分析方法初步探讨蚯蚓中存在的其它纤溶酶活性组分。结果分离纯化得到了EFE单一组分,经SDS-PAGE EFE呈单一条带,Mr约为25 000。经酶谱分析发现纤溶酶活性组分Mr分布在25 000~50 000之间。结论反复使用色谱技术可分离纯化EFE,并得到单一组分。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

广西菲牛蛭中一种纤溶酶的分离纯化

目的从广西菲牛蛭消化液中分离纯化出一种纤溶酶,并研究其生化性质。方法应用有机溶剂沉淀、DEAESepharoseCL-6B离子交换柱和SephadexG-75凝胶柱过滤的方法分离纯化出广西菲牛蛭纤溶酶,用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纤溶酶相对分子质量(Mr)。结果从广西菲牛蛭中分离出一种单一组分的纤溶酶,其Mr约为42×103,在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白,收率为0.43%。结论此方法成功地从广西菲牛蛭中分离出一种纤溶酶,其纤溶机理是直接溶解纤维蛋白。     

巴斯德毕赤酵母表达人微小纤溶酶原的放大研究

目的:研究巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人微小纤溶酶原(rh-mPlg)的放大工艺。方法:分别采用1 L摇瓶、7.5 L发酵罐对Pichia pastoris工程菌rh-MPLG/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达。摇瓶培液经2步纯化:SP-Seph-arose FF、Superdex 75;发酵罐培液经3步纯化:超滤、Sephacryl S-100、Q-Sepharose FF,活性组分透析后冷冻干燥。以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)激活rh-mPlg,纤维蛋白平板测定其纤维蛋白溶解活性,计算并比较2种制备方法所获rh-mPlg比活性及得率。结果:采用1 L摇瓶和7.5 L发酵罐发酵可分别获得34 mg.L-1培液、210 mg.L-1培液的得率,经纯化后rh-mPlg纯度分别为95%和97%,比活性分别为20.6和23.0 U.mg-1。结论:以发酵罐生产rh-mPlg,可显著提高其产量,且比活性与摇瓶表达相近,验证了放大生产的可行性。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及抗栓活性研究

目的摸索蚯蚓纤溶酶的分离纯化工艺和研究蚯蚓纤溶酶的抗血栓活性。方法采用分步盐析、透析、凝胶色谱和亲和色谱法分离纯化蚯蚓纤溶酶 ;此酶的体内抗栓活性检测采用动静脉旁路血栓形成抑制实验法。结果分离纯化得到的蚯蚓纤溶酶比活高 ,为 16 0 5IU/mg ;蚯蚓纤溶酶的体内血栓形成抑制效果比尿激酶作用显著。 结论该法分离纯化工艺简单 ,特异性好 ,纯化的纤溶酶比活高 ;体内抗栓活性比尿激酶作用显著     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

T4溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及抑菌活性测定

目的利用毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白并测定其抗菌活性。方法T4溶菌酶（T4lysozyme）基因以N端融合的方式被准确插入到质粒pPIC9K的EcoR I-Not I位点内,得到分泌型重组表达载体 pPIC9K-T4L。该载体首先经限制性内切酶Sal I酶切,进而采用电击方法将线性化的重组质粒DNA导入到毕赤酵母中。经过梯度筛选得到多个单拷贝和多拷贝转化重组子。随机挑取部分重组子PCR扩增阳性克隆,经菌体培养和甲醇诱导后获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清液中。结果表达蛋白经琼脂孔扩散抗菌实验显示抑菌圈明显;重组蛋白对金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌均具有显著抑制作用;多拷贝与单拷贝重组表达子没有抗菌活性差异与蛋白表达量的差异;加热煮沸对于T4溶菌酶蛋白的抗菌活性无明显影响。结论T4溶菌酶在毕赤酵母中得以成功诱导与表达;表达产物不受拷贝数影响并具热稳定性。     

猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的　优化猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法　毕赤酵母转化菌在 BMMY、BMM、MM及各加 1%酪蛋白水解物 (CA)的诱导培养基中经 0 .5 %甲醇诱导表达后 ,上清液行 SDS- PAGE。结果　高拷贝毕赤酵母转化菌 SMD116 8的表达水平高于酵母转化菌 GS115 ;Mut S型比 Mut+型表达量高 ;表达水平与拷贝数呈正相关 ,即拷贝数越高 ,表达量也越高 ;在诱导培养基 BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基 ;阴性对照菌未见目的表达条带。结论　猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化 ,为大量制备生产打下了基础。     

人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白质的毕赤酵母。方法重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HSA(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中。电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达。结果融合基因约为2 200 bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HSA的杂合分子。结论实现了HSA-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达。     

巴斯德毕赤酵母启动子研究进展

目前,巴斯德毕赤酵母表达系统是非常成功的外源蛋白表达系统之一,其启动子的开发和利用也备受关注.醇氧化酶1启动子(alcohol oxidase 1 promoter,PAOX1)在巴斯德毕赤酵母中应用最为广泛.鉴于外源蛋白表达的需要,不断有启动子被发现和利用,如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,PGAP)、甲醛脱氢酶1启动子(formaldehyde dehydrogenase 1 promoter,PFLD1)等.此文列举了多种巴斯德毕赤酵母启动子,并对启动子的来源、特点以及外源蛋白的表达等方面进行综述,以期为启动子的选择提供参考.     

人组织因子的密码子优化及其在毕赤酵母中的高水平发酵制备

优化人组织因子编码序列利用毕赤酵母表达系统高水平发酵制备重组人组织因子。将人组织因子胞外活性区(hTF219)编码序列进行密码子偏爱性、GC含量及富AT区的优化,优化序列电转入毕赤酵母表达系统;利用博莱霉素(Zeocin)梯度抗性平板筛选出高表达转化子;在1L发酵罐中采用混合碳源连续补料方式发酵制备重组蛋白。替换hTF219编码cDNA的165个碱基,获得的优化序列与原始序列的相似性为75%;在Zeocin浓度为500μg/mL的YPD平板上筛选得到高表达转化子tfPP-502,该重组菌株以组成型方式分泌表达重组人组织因子,在1L发酵罐中发酵110 h胞外总蛋白含量为6.27 g/L,目的蛋白占比约80%。在毕赤酵母表达系统中实现了重组人组织因子的高水平发酵制备获得的重组菌株可用于重组人组织因子的大规模发酵制备。     

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。