肿瘤坏死因子α调控启动子活性促进netrin-1的表达

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究。方法 使用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α对netrin-1表达影响。PCR反应克隆出netrin-1启动子序列,构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶报告基因表达载体。转染HEK-293A细胞检测荧光素酶活性。观察细胞因子TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控。结果 首先证实了TNF-α能够上调Netrin-1的表达。其次成功构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性。发现肿瘤坏死因子TNF-α可以使netrin-1启动子活性显著增加 (P<0.05),TNF-α以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性。结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin-1的表达。     

GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究

目的 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有上游激活序列(UAS)启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体组成的GAL4/VP16-UAS系统,观察融合转录因子GAL4/VP16的活性.方法 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体pcDNA3-GAL4/VP16,含有5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因核心启动子的人工杂合启动子驱动报告基因EGFP的表达载体pGL3-G5E1b-TATA-EGFP,利用脂质体将两种载体瞬时转染Hep3B和HEK293细胞,48 h后采用RT-PCR和流式细胞术检测EGFP的表达,观察GAL4/VP16融合转录因子对G5E1B-TATA的转录调节作用.结果 在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下,G5E1b-TATA启动子活性明显上调,甚至可以达到巨细胞病毒(CMV)启动子的活性程度.结论 GAL4/VP16融合转录因子具有上调G5E1B-TATA启动子转录活性的作用,并且该转录活性足以达到驱动下游目的基因高效表达的水平,在基因治疗和基因功能的研究中具有一定的应用潜力.     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

Klotho基因启动子区域定位及活性分析

目的构建含不同长度klotho基因启动子片段的报告基因载体,研究其在不同细胞系中的转录活性。方法以人全血基因组DNA为模板,克隆长短不同的klotho基因启动子片段,命名为klothoⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建真核表达载体;采用Lipofectamine 2000将重组质粒分别和pRL-TK共转染HEK293和HeLa细胞,分析不同长度的klotho基因启动子片段在细胞内的转录活性。结果双酶切和测序鉴定均显示表达载体构建成功;klotho基因的核心启动子区域位于-504～-6;双荧光素酶活性检测显示klothoⅢ在2种细胞中的转录活性明显高于klothoⅠ、Ⅱ(P<0.05),而klothoⅣ的转录活性在HEK293细胞中能维持高水平,在HeLa细胞中显著下降(P<0.01)。结论 klotho基因启动子在不同细胞中的转录活性不同,-973～-504区域可能是导致HeLa细胞中klothoⅣ转录活性下降的原因。     

shRNAmir慢病毒载体沉默鼻咽癌细胞中环氧合酶-2的表达

目的 构建基于miR-155结构的shRNAmir慢病毒表达载体,在鼻咽癌细胞中沉默COX-2基因的表达,探索全新的COX-2抑制方法.方法 转染小干扰RNA(siRNA),筛选出沉默COX-2表达的RNA干扰序列,以该序列替换miR-155前体序列中的双链部分作为anti-COX-2 shRNAmir转录模板,构建pLVTHM/shRNAmir慢病毒质粒表达载体,利用293FT细胞包装pLVTHM/anti-COX-2 shRNAmir慢病毒.感染鼻咽癌C666-1细胞后,通过流式分选,建立anti-COX-2 shRNAmir稳定表达,COX-2基因沉默的亚系.结果 设计合成的anti-COX-2a siRNA能够使COX-2 mRNA表达下降90%以上,根据其序列构建的plVTHM/sbRNLAmir质粒载体测序无误,pLVTHM/anti-COX-2 shRNAmir慢病毒感染C666-1细胞后,分选出亚系C666-1经反复传代仍可保持COX-2基因沉默的表型.结论 pLVTHM/shRNAmir慢病毒载体能够转录出基于miR-155结构的shRNAmir,沉默鼻咽癌细胞COX-2的表达,为探索更加高效安全的COX-2抑制剂奠定基础,也为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新手段.     

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的：利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子——目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法：将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子——Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果：利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。     

GPC3启动子报告基因载体构建与转录活性分析

目的 构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)启动子荧光素酶报告基因载体,并验证其转录活性.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR扩增GPC3启动子基因片段,克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上,通过转染HepG2细胞检测荧光素酶活性来验证GPC3启动子的转录活性.结果 GPC3基本启动子和全长启动子分别成功构建到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,GPC3基本启动子具有很强的转录活性,而全长启动子的转录活性比基本启动子高4倍以上.结论 成功构建了GPC3启动子荧光素酶报告基因载体,为研究GPC3转录调控提供了重要手段.     

人BRD8启动子系列报告基因的构建和鉴定

目的: 构建具有相同3'末端而5'末端逐渐截短的人BRD8启动子系列报告基因,并进行鉴定。方法: 聚合酶链反应(PCR)从人基因组中扩增BRD8启动子片段并插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic;以已构建的BRD8报告基因为模板,分别用PCR扩增具有相同3'末端而5'末端逐渐截短的BRD8启动子系列片段,并分别插入pGL3-Basic载体。对BRD8启动子系列报告基因进行酶切鉴定、测序。结果: 通过酶切鉴定、测序,证明构建的BRD8启动子系列报告基因序列和方向正确。结论: 成功构建了人BRD8启动子系列报告基因,为进一步研究调节BRD8基因表达的特异性转录因子和(或)沉默子奠定了基础。     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的：鉴定小鼠miR-155基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制。方法：分别构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。将miR-155表达载体与miR-155启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性。选取miR-155基因转录起始位点(TSS)上游2 000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1型和M2型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达。结果：成功构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155基因TSS上游1～500 nt、1～1 000 nt及1～2 000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155基因TSS上游1～2 000 nt均为miR-155基因的启动子区域,其中1～500 nt为启动子核心区域。转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155基因TSS上游1～2 000 nt...     

CLONING PROMOTER OF HUMAN SATBl GENE AND EFFECT OF ATRA AND CoCl_2 ON ITS ACTIVITY

Objective To explore the structure and activity of SATBI promoter in different cells, ATRA and CoCl2 effect on its activity. Methods Using luciferase system to assay the promoter activity of human SATB1 gene, three luciferase reporter vectors were constructed which driven by different regions of 5' untranslated sequence from human SATB1 gene, called pGL3-SP2946-luc, pGL3-SP1718-luc and pGL3-SP751-luc, and transfeted into Jurkat T,K562, U937 and Hela cells transiently using lipofectinamine, the expression activity was detected at different dosage of ATRA and CoCl2 treatment for different time course. Results The reporter gene expression from SATB1 promoter were high activity in U937 cell, moderate in Jurkat T cell, low activity in K562 cell and showed no obvious activity in Hela cell, the reporter gene expression from pGL3-SP751-luc kept on the higher lever in Jurkat T,K562 and U937 cells than the other two vectors. We also found that the repressive effect of CoCl2 on SATBI' s mRNA expression and the relative luciferase expression from pGL3-SP751~luc in U937 cell was down-regulated obviously by ATRA and CoCl2 in the concentration- and time-dependent manners. Conclusion SATB1 promoter drives gene expression with cell-specificity and its core promoter region maybe exist in the - 751 ~ - 9bp of 5' untranslated region of human SATBI gene. Combined with the experiment result we found before that SATB1 was down-regulated by ATRA in U937, the results imply that STAB1 maybe is down-regulated by ATRA and CoCl2 through its promoter in the differentiation of myeloid cell line-U937.     

人牙釉质蛋白Amelotin，Ameloblastin及Enamelin基因启动子的初步研究

目的分析人釉成熟蛋白（Amelotin,AMTN）、成釉蛋白（Ameloblastin,AMBN）与釉蛋白（Ename—lin,ENAM）基因上游启动子序列,构建不同长度的基因上游启动子报告基因载体,为进一步判断启动子序列的转录调控区奠定基础。方法利用软件分析基因启动子序列,以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中。结果成功地获得了不同长度的Amelotin,Ameloblastjn及Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功。结论成功构建了不同长度启动子的pGL3．Basic荧光素酶报告基因载体,为进一步研究牙釉质蛋白2基因启动子的转录活性及转录调控特点奠定基础。     

人釉成熟蛋白Amelotin基因的启动子活性区域分析

目的构建人牙釉质蛋白（Amelotin,AMTN）基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,比较不同的启动子片段在成釉细胞及Hela细胞中的活性,为进一步判定上游启动子的转录调控区奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3．Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Amelo—tin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在不同的细胞中活性不同,-190～-358与-35～-93区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Ame｜otin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Amelotin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Amelotin基因转录调控特点奠定基础。     

泛素水解酶22调控丝裂原活化蛋白激酶激酶6基因的转录活性

目的：克隆丝裂原活化蛋白激酶激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6)基因启动子,研究泛 素水解酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)对MKK6转录活性的调控作用。方法：采用PCR扩增MKK6基因启动 子片段,并以该片段为模板对USP22结合位点进行定点突变,将野生型与突变型启动子片段定向插入荧光素酶表达 载体pGL3-Basic;用重组载体与内参质粒pRL-TK共转染HeLa细胞,行双荧光素酶活性检测以确定其转录活性;利用 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验观察USP22蛋白与MKK6启动子是否存在直接的结合;下 调USP22表达后,检测MKK6转录活性的变化。结果：成功扩增MKK6启动子及其突变体并构建荧光素酶表达载体; USP22结合位点的突变导致该启动子活性在HeLa细胞中明显降低(P<0.05);USP22与MKK6启动子在细胞中存在直接结 合;抑制USP22的表达导致MKK6转录水平明显下降(P<0.05)。结论：在HeLa细胞中,USP22有效地调控MKK6基因的 转录。     

人EFTUD2启动子的鉴定及初步分析

目的：鉴定并分析EFTUD2（elongation factor Tu GTP?binding domain?containing 2）基因的启动子区域。方法：应用生物信息学技术对EFTUD2基因结构及潜在启动子区域进行分析,预测4个EFTUD2启动子序列。使用全基因合成技术以及高保真PCR扩增得到目的启动子序列,通过BglⅡ和NheⅠ双酶切,将目的条带克隆到双荧光素酶报告基因载体psiCHECK?2中,得到4个长度不同并覆盖EFTUD2基因转录起始位点附近约2 kb的EFTUD2基因启动子双荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶分析检测启动子活性。结果：经酶切、测序鉴定,成功构建了人EFTUD2启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性检测,重组体EFTUD2?0.5的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）,提示EFTUD2基因核心启动子序列位于转录起始位点附近约500 bp的区域内。结论：EFTUD2基因转录起始位点上游500 bp具有启动子活性,初步判定其核心启动子位于该区域。     

人釉蛋白基因启动子在成釉细胞中的转录活性研究

目的构建人釉蛋白（Enamelin,ENAM）基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,通过分析不同的启动子片段的活性,确定启动子的功能区域,为进一步研究Enamelin基因的转录调控机制奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Ehamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在成釉细胞中活性不同,-1216～-554与-312～-133区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Enamelin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Enamelin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Enamelin基因转录调控特点奠定基础。     

hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录

目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.