基于α-病毒复制酶的基因疫苗对人黑色素瘤的免疫作用

目的研究基于α-病毒复制酶的人黑色素瘤基因疫苗免疫学作用.方法建立及鉴定人/鼠嵌合模型(trimera),将基于α-病毒复制酶的mage-3基因疫苗免疫动物,检测动物体内特异抗体滴度;用标准4 h51Cr释放实验检测动物体内特异CTL活性.结果FACS分析显示,trimera小鼠腹腔细胞中人白细胞占总细胞的88.84%,脾脏细胞中人白细胞的比例占57%,同国外文献报道一致.基于α-病毒复制酶的重组基因疫苗mage-3/pSMART2a对trimera小鼠免疫后,小鼠腹腔细胞的CTL在效靶比为100:l时杀伤率达到70%左右,此时的对照组mage-3/pCI-neo组最大杀伤率为40%左右.ELISA结果显示,重组基因疫苗mage-3/pSMART2a组产生的mage-3抗原特异性抗体效价达到1:512,mage-3/pCI-neo组为1:256.结论成功建立了人/鼠嵌合模型,并在动物体内激发出针对人黑色素瘤基因疫苗的初次免疫应答.     

小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原P1A的克隆与表达

目的 克隆小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞株的ＰＩＡ基因以制备肿瘤ＤＮＡ疫苗,方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法制备ＰＩＡ基因,以哺乳细胞高效表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ为载体,构建重组ＤＮＡ疫苗。重组体用克隆位点上游和下游的Ｔ７和Ｔ１３启动了序列为测序引物,用自动测序仪测定鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用磷酸钙法转化２９３细胞,用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定转化细胞中ＰＩＡ基因的表达。结果 正确构建了ＰＩＡ／ｐＣＩ－ｎ     

小鼠肥大细胞瘤基因疫苗的免疫治疗作用研究

目的：探讨α－病毒RNA复制酶对基因疫苗的免疫学效应的加强作用，寻找更好的基因疫苗形式。方法：将小鼠肥大细胞瘤P815的肿瘤特异抗原PIA基因克隆到含SFV的RNA复制酶的真核表达载体pSMART2a中，以此作为肿瘤基因疫苗，观察该疫苗对P815种植瘤的防治作用、特异细胞毒T淋巴细胞激活和抗体的生成情况。结果：该重组基因疫苗在体外有很好的表达，注射后CTL的最大杀伤率为60%，而普通载体疫苗形式pCI-neo/PIA则只有40%的杀伤活性；在观察期限内，前者的动物成瘤率和动物生存率分别为20%和40%。后者则分别为60%和20％。两种情况下都不能检测到任何特异抗体的产生。结论：α－病毒RNA复制酶对基因疫苗的免疫学效应有加强作用。     

MAGE-E1a荧光真核表达载体的构建

目的：构建MAGE-Ela与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体，为研究肿瘤疫苗中树突状细胞的作用奠定基础．方法：应用基因重组技术，将反转录PCR得到的MAGE-Ela基因克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中，用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子经SalⅠ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定．结果：MAGE-Ela基因成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP-N3中，获得MAGE-E1a／pEGEP-N3重组质粒．结论：MAGE-E1a基因克隆入pEGFP-N3质粒，成功构建MAGE-E1a／pEGFP-N3荧光真核表达载体，解决了MAGE-E1a基因转染的定位问题，为研究肿瘤疫苗奠定了基础。     

含有NURR1基因的重组复制缺陷性腺病毒的构建和鉴定

【目的】构建并鉴定携带NURR1基因的重组复制缺陷腺病毒高效表达载体，为基因调控神经干细胞分化后治疗帕金森病奠定基础。【方法】将测序鉴定正确的NURR1基因插入穿梭质粒pTrack—CMV后，与Adeasy整合，重组Adeasy质粒在肾293A细胞内包装成病毒，PCR鉴定并测定病毒滴度，电镜鉴定病毒颗粒。【结果】成功构建的穿梭质粒pTrack—CMV—NURR1与pAdeasy整合后，重组Adeasy质粒在肾293A细胞内包装和复制时，细胞病变效应(cytopathogenic effect，CPE)明显，PCR鉴定病毒DNA中有NURR1基因，病毒滴度测试表明病毒含量高，电镜显示病毒为多面体。【结论】成功构建出含有NURR1基因的重组复制缺陷性腺病毒表达载体。     

可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达

目的构建以塞姆利基森林病毒复制子载体为基础的可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,验证其在人胚肾293T细胞及免疫小鼠肌肉组织内的表达情况。方法首先用NheI酶切既往构建的pVAX1-2PFcGB重组质粒,补平酶切后的粘末端,然后再用限制性内切酶BssHII继续酶切该线性化质粒,补平粘末端后即获得含有编码Survivin及hCGβ-CTP37肿瘤抗原的融合基因片段2PFcGB,接着利用DNA重组技术将该片段克隆入基于塞姆利基森林病毒复制子载体改造的PSCK载体,筛选阳性重组质粒。接着,利用阳离子脂质体介导法将其瞬时转染入人胚肾293T细胞,利用流式细胞术及免疫荧光法检测融合抗原在293T细胞中的表达;利用电脉冲基因导入仪将该重组质粒递送至BALB/C小鼠股四头肌,利用免疫组化法验证肿瘤抗原在小鼠体内的表达。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致,流式细胞术检测该重组质粒瞬时转染的293T细胞,可见大量的阳性荧光细胞,其IRES序列上游融合肿瘤抗原分子阳性表达率为5.70%,下游佐剂分子阳性表达率为19.75%;同时,利用两种肿瘤抗原特异抗体在免疫小鼠股四头肌组织切片上均检测到了相应表达。结论成功构建了可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,该重组质粒在体内外均能高效表达外源肿瘤抗原及佐剂分子,这些结果为该抗肿瘤DNA疫苗进一步的抑瘤活性及免疫学作用机制的研究奠定了坚实的实验基础。     

肿瘤抗原P1A与细胞因子mGM-CSF共表达载体的构建和表达

目的：构建并鉴定细胞因子mGM-CSF和肿瘤特异抗原PIA共表达载体，为研究新型的肿瘤疫苗提供新的策略。方法：以PCR方法从pCI-neo／PIA中扩增出PIA编码基因片段，构建于pRSC质粒上；再从pORF-mGM-CSF中扩增出mGM-CSF基因片段．插入pRS-PIA重组质粒PIA基因的上游。以酶切和DNA测序进行鉴定。并将鉴定过的重组质粒以脂质体法转染7721细胞．用RT-PCR法鉴定转染细胞中PIA基因和mGM-CSF基因的表达。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实mGM-CS17和PIA重组质粒构建正确，并在转染此质粒的7721细胞中检测出了PIA和mGM-CSF基因的表达。结论：成功构建mGM-CSF和PIA的共表达载体，为研制新型肿瘤疫苗奠定了基础。     

以HBc颗粒为呈现载体的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel探索其作为DNA疫苗载体的可能性。方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc—core的HBcAg el—loop处添加Nhel酶切位点，双酶切此重组载体pTrc-core^Nhel及真核表达载体pcDNA3．1，产物经纯化、T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选抗Amp^＋克隆并提取质粒进行酶切及PCR鉴定。结果成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-HBc^Hhel。结论该重组质粒可作为治疗性及预防性疫苗的候选载体，为深入研究预防性及治疗性疫苗奠定了基础。     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因研究

目的 分析金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因与耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药的相关性。方法 采用琼脂二倍稀释法测定246株铜绿假单胞菌对14种抗菌药物的敏感性,Etest法进行金属酶表型的筛选,PCR检测金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因。结果 检出102株多重耐药株,21株广泛耐药株,分别占41.5%和8.5%;亚胺培南耐药组筛选出金属酶表型阳性24株,阳性率为37.5%,敏感组未检出;亚胺培南耐药组经PCR扩增金属酶阳性21株,阳性率为32.8%,其中8株为IPM-1,9株为IPM-2,4株为NDM-1,未检出VIM-1、VIM-2;敏感组株未检出金属酶基因,两组的检出率差异具有统计学意义(P<0.05);21株金属酶阳性和表型结果一致;耐药组耐消毒剂基因qacE?1阳性率为81.25%,敏感组阳性率为75%,两组间的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 耐亚胺培南铜绿假单胞菌表现为多重耐药;金属β-内酰胺酶基因的存在和其产生的金属酶是本地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一,其基因型主要为IPM-1、IPM-2和NDM-1,铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药还存在其他的主要机制;NDM-1阳性铜绿假单胞菌对头孢类抗生素、呋喃妥因、碳青霉烯类等多种抗菌药物耐药;合理使用有效的消毒剂将有利于控制NDM-1阳性菌的传播。     

基因枪在肿瘤基因治疗中的应用价值

目的 研究基因枪经小鼠皮肤转移基因的效率、被转基因的表达量、表达时间,以及对小鼠肿瘤的治疗效果,探讨作为一种 基因转移工具,基因枪在基因治疗中应用的可能性。方法 （１）用荧光显微镜观察基因枪对体外培养细胞系的基因转导效率和被转基因表达时间;（２）通过基因枪向小鼠皮肤转Ｌａｃ￣Ｚ基因后,取转瓣皮肤做冰浇灌发片进行β－ｇａｌ染色,观察转基因蛋白在皮人中表达的部位;（３）用ＥＬＩＳＡ法检测向小鼠皮肤转ｍ     

ApoE、A2M、ACE基因与汉人Alzheimer病的相关性研究

目的 探讨山西汉族人群载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)基因、a2-巨球蛋白(alpha-2 macroglobulin,A2M)基因、血管紧张素转换酶(angiotensin convening enzyme,ACE)基因多态性与Alzheimer病(AD)的相关性.方法 采用聚合酶链反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和电泳技术,观察山西汉族群体114例(AD患者55例,正常对照59例)的apoE基因、A2M基因、ACE基因多态性的分布并进行关联性分析.结果 AD组和对照组之间apoE各基因型分布总体比较其差异有统计学意义(P<0.05),其中ε4等位基因两组间比较存在明显统计学差异(P=0.000 2),且OR值大于5;AD组和对照组A2M各基因型、等位基因分布总体比较其差异有统计学意义(P<0.05).其中Ⅰ/Ⅴ基因型和Ⅴ等位基因与AD均呈显著正相关(Ⅰ/Ⅴ,基因型OR=2.85,95%CI=1.14-7.14;V等位基因OR=2.49,95%CI=1.05-5.89);两组间ACE各基因型及等位基因间的差异均无统计学意义(P>0.05).且按年龄、血压分层后AD组和对照组中ACE基因型及等位基因的分布差异无统计学意义;按是否携有apoE ε4分层后AD组和对照组A2M、ACE各基因型及等位基因两组分布均无差异(P>0.05).结论 apoE、A2M基因是晚发性AD的危险因子;AcE基因与晚发性AD不存在关联,还不能认为是晚发性AD的危险因子;且A2M基因、ACE基因与apoE基因无相互作用.     

携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体的构建

目的构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础。方法将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his。其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度。结果所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功。测定病毒50%组织培养感染剂量(TCID50)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml。结论成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准。     

卡介苗ERP基因置换型打靶载体的构建

目的：构建ERP基因打靶载体。方法：卡介前菌体外培养,扩增ERP基因两侧序列．连接载体与目的片段．筛选阳性克降并鉴定。结果：PCR扩增捕入片段大小与预期相符．鉴定证实PCR产物及插入片段为所需目的基因片段。结论：成功构建了用于卡介苗菌基因打靶的置换型载体,为今后构建ERP基因敲除株的卡介苗突变株的研究奠定基础。     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

核素报告基因显像在基因治疗监测中的应用

基因治疗作为一种新的疾病治疗方法,展示了广阔的临床应用前景;但基因治疗中仍存在着许多亟待解决的问题,尤其是如何实现在活体条件下对治疗基因的定位及表达进行监测和评估.放射性核素报告基因显像是近年来发展迅速的一种无创、灵敏的活体内监测基因表达的方法,具有灵敏度高和特异性强的优点,并可进行深部组织显像和重复显像,展示了良好的应用前景.文章就放射性核素报告基因显像用于监测基因治疗的原理、特点及应用进行综述.     

无毛基因及其突变后引起的免疫学改变

无毛小鼠(hairless mice)是一种皮肤毛发结构表型性状发生遗传突变的小鼠,表现为被毛缺失或逐渐消失,包括有不同基因突变引起的多种类型,最早于1924年在伦敦的一家饲养场中偶然发现,当时认为是由野生型的Musmusculus突变所致。无毛小鼠不同于课鼠(nude mice,指一种先天性无胸腺无毛的裸体     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

面向精准医学的基因突变数据分类与融合研究

目的：通过调研现有的基因突变数据标准,包括分类标准、命名标准以及组织标准,制定一套整合式的基因突变数据分类体系以 融合多来源异构的突变数据。方法：从ClinVar和COSMIC突变数据库中获取基因突变数据,根据数据特征对基因突变数据进行标准化融合。通过与已制定的分类体系进行映射,对融合后的基因突变数据进行标准化分类注释。结果：构建的基因突变分类体系包括术语34条,突变数据库包括突变概念746 504个,突变术语1 083 397个。结论：基因突变数据分类体系可提供一种有效的基因突变数据分类和突变数据整合方案,对推动突变数据的融合、标准化与共享和疾病的精准治疗具有重要意义。