大豆异黄酮在缺氧条件下诱导食管癌细胞凋亡及对HIF-1α表达的影响

目的研究在缺氧条件下大豆异黄酮(soybean isoflavone)对人食管癌细胞株ECa109生长抑制作用及可能机制.方法运用产气袋法(GasPaK)制造缺氧条件,实验分为对照组、大豆异黄酮组、缺氧对照组、缺氧大豆异黄酮组,用MTT法检测常氧和缺氧条件下药物效应.流式细胞仪分析各组细胞周期分布,透射电镜观察细胞超微形态的改变,S-P免疫组化法检测各组细胞HIF-1α和Fas的表达.结果不同浓度大豆异黄酮不同氧条件下对人食管癌细胞株ECa109生长均有抑制作用,并呈剂量-效应关系.缺氧条件下大豆异黄酮对人食管癌细胞株ECa109生长抑制作用增加.常氧和缺氧条件下大豆异黄酮处理后细胞均滞留于G2/M期,缺氧大豆异黄酮组凋亡率增加.透射电镜观察常氧下及缺氧条件下大豆异黄酮处理后细胞出现凋亡和坏死细胞的形态学改变.大豆异黄酮不同氧条件下均上调Fas表达,并能下调因缺氧表达增加的缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达.结论大豆异黄酮对人食管癌细胞生长有抑制作用,其抑制作用可能通过阻抑细胞周期进程,上调Fas蛋白表达,从而诱导食管癌细胞凋亡而实现的.缺氧条件下大豆异黄酮抑制作用增强,抑制HIF-1α的表达可能是其重要机制.     

HRE1.Egr-1.yCDglyTK融合自杀基因前药系统对鼻咽癌放射增敏作用的体外实验

目的:构建缺氧/辐射双敏感性启动子HREI.Egr-1,观察其在缺氧或放射诱导下调控yCDglyTK基因在鼻咽癌HNE-1细胞表达及yCDglyTK/5-FC对鼻咽癌HNE-1细胞杀伤效应,为探索新的鼻咽癌基因-放射治疗奠定实验基础.方法:利用基因重组技术构建嵌合启动子HRE1-调控yCDglyTK基因表达的质粒载体;脂质体介导重组质粒转染鼻咽癌HNE-1细胞,建立稳定表达yCDglyTK基因的鼻咽癌HNE-1转染细胞;免疫印迹法检测在常氧、放射、乏氧、乏氧加放射等不同条件下HNE1细胞中yCDglyTK表达的强度;MTY法检测加入5-FC后对上述不同条件下稳定转染细胞的杀伤效应.结果:各组蛋白表达均有差别(P＜0.01),以乏氧/放射处理最为明显;5-FC对各种条件干预下的细胞均有杀伤效应,其中以乏氧/放射处理最为明显(P＜0.01).结论:HRE1.Egr-1嵌合启动子具有放射和乏氧诱导的双重特性,可以显著增强yCDglyTK/5-FC系统在乏氧和放射干预下对鼻咽癌HNE-1细胞的杀伤效应,为鼻咽癌的基因-放射治疗开辟了新思路.     

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞糖酵解相关基因表达的影响

目的:探讨常氧及缺氧培养对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及糖酵解相关基因表达的影响?方法:选择3组细胞分别为食管鳞癌Eca-109细胞稳定转染HIF-1α siRNA及空质粒的Eca-109细胞,予以常氧和缺氧培养,缺氧培养时间分别为6?12?24?48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白表达,Western blot和RT-PCR检测3组细胞常氧和缺氧条件下糖酵解相关基因(Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ)的表达,分光光度法分别测定3组细胞常氧和缺氧培养下胞液中乳酸脱氢酶(LDH)?己糖激酶(HK)酶活性?结果:Eca-109细胞缺氧条件下培养,HIF-1α蛋白表达较常氧时增高,干扰细胞常氧下HIF-1α几乎无表达,缺氧后亦无增强?常氧和缺氧条件下,干扰细胞Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ mRNA和蛋白表达较未干扰细胞明显减弱(P < 0.05),干扰细胞胞液LDH?HK活性较未干扰细胞明显减少(P < 0.05)?结论:RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达,进而不同程度减少Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ糖酵解相关基因的表达?     

抑制miR-186表达可减轻缺氧状态下血管内皮细胞线粒体的损伤

目的探讨抑制miR-186表达对血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α表达的影响和缺氧状态下线粒体功能的影响。方法构建 人脐静脉内皮细胞缺氧培养模型,检测正常培养组与缺氧培养6 h 组人脐静脉内皮细胞（HUVECs）miR-186 表达量。干扰组 HUVECs细胞转染miR-186-inhibit 48 h,干扰miR-186表达,对照组转染对照inhibit。检测miR-186的表达以确定干扰效果,干 扰成功后缺氧培养6 h后观测实验组和对照组电镜下线粒体结构。干扰miR-186表达后检测缺氧诱导因子-1α的mRNA和蛋白 表达。结果缺氧培养6 h 的HUVECs 细胞中miR-18 表达轻度上升（P=0.0188）。转染miR-186inhibit 48 h 可干扰miR-186 70%~80%的表达,干扰miR-186表达促进缺氧诱导因子-1α的mRNA和蛋白表达。干扰组缺氧培养6 h,电镜下线粒体损伤明显 减轻（P=0.00297）。结论干扰miR-186通过促进HIF-α上调,改善线粒体损伤,保护血管内皮细胞。靶向干扰miR-186可能有 助于失血性休克的治疗。     

siRNA沉默EPAS1基因对胰腺癌细胞凋亡和增殖的影响

目的 研究由2型重组腺相关病毒(rAAV2)介导的靶向缺氧诱导因子2(EPAS1/HIF-2)的小干扰RNA(siR-NA)对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡和增殖的影响.方法 将人胰腺癌细胞株PANC-1分为实验组、阴性对照组(阴性组)和空白对照组(空白组),实验组和阴性组分别转染rAAV2-EPAS1-siRNA和rAAV2-EGFP病毒,空白组不转染病毒,进行常氧和缺氧培养.RT-PCR和Western blot检测EPAS1基因表达,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力.结果 在常氧和缺氧状态下,实验组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达受抑制,显著低于阴性组和空白组,差异均有高度统计学意义(p<0.001).在缺氧状态下,实验组细胞的凋亡率明显升高,增殖受抑制,与阴性组和空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 通过siRNA抑制缺氧状态下胰腺癌细胞中EPAS1基因表达,能诱导胰腺癌细胞凋亡,抑制胰腺癌细胞增殖.     

11,12-环氧二十碳三烯酸对缺氧/复氧诱导的内皮细胞损伤及细胞间黏附因子-1表达的影响

目的观察11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-epoxyeicosatrienoic acids,11,12-EET)对缺氧/复氧诱导的内皮细胞损伤以及黏附分子表达的影响,了解环氧二十碳三烯酸发挥血管保护作用的可能途径,初步探讨其作用机制。方法采用原代培养人脐静脉内皮细胞,用数字表法将其随机分为对照组、11,12-EET对照组、缺氧/复氧组和11,12-EET缺氧/复氧组。通过向培养瓶内通入混合气体(2%O2,5%CO2,93%N2)3h,复氧1h,复制缺氧/复氧损伤模型。采用MTT法检测细胞活力,用比色法检测培养液中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的变化,用RT-PCR法检测细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)mRNA表达,用酶联免疫吸附实验测定细胞间黏附分子-1蛋白表达,用Western blotting方法检测蛋白激酶B(Akt)。结果11,12-EET在常氧条件下可对细胞造成轻度损伤,在缺氧/复氧条件下能显著提高内皮细胞的存活率,提高SOD的活性,降低MDA的含量,抑制细胞间黏附分子-1 mRNA和蛋白的表达,提高Akt的表达。结论11,12-EET具有减轻内皮细胞缺氧/复氧损伤作用,这可能与其能提高缺氧/复氧条件下内皮细胞SOD活性、清除氧自由基、抑制细胞间黏附分子-1 mRNA和蛋白的表达和促进Akt的表达有关。     

缺氧预处理对 L02肝细胞Bcl-2、Bax、Fas及FasL表达的影响

目的:研究缺氧预处理对正常肝细胞株L02缺血再灌注损伤的抗凋亡机制.方法:将体外培养的L02细胞分为3组:正常对照组(A组)、缺氧复氧损伤组(B组)、缺氧预处理组(C组).各组细胞缺氧复氧处理1、6、1 2、18、24 h后,使用流式细胞术检测细胞凋亡率,各组细胞分别缺氧复氧、缺氧预处理后12 h检测细胞Bcl 2、Bax、Fas及FasL蛋白表达,同时对细胞结构进行电镜观察.结果:C组和B组比较,细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),细胞Bcl-2蛋白表达明显升高(P＜0.05),Bax、Fas及FasL蛋白表达量显著降低(P＜0.05),透射电镜观察到缺氧预处理组细胞结构基本正常.结论:缺氧预处理明显减轻了缺氧复氧所导致的L02肝细胞损伤,降低了细胞凋亡率,缺氧预处理保护机制和Bcl-2、Bax、Fas及FasL蛋白表达有关.     

氯化锂调节趋化因子Fractalkine表达抑制缺氧复氧诱导的血管内皮细胞损伤

目的:观察缺氧复氧诱导人脐静脉血管内皮细胞(Human umbillcal vein endothelial cells,HUVECs)损伤和趋化因子(Fractalkine,FKN)表达变化及氯化锂(Lithium chloride,LiCl)的干预效应。方法:体外培养HUVECs并随机分为对照组、缺氧复氧组和LiCl 5、10 mmol/L组。MTT法测定HUVECs的存活率,流式细胞术检测HUVECs凋亡率,免疫细胞荧光技术检测HUVECs的FKN蛋白表达,RT-PCR技术检测HUVECs的FKN mRNA表达。结果:与对照组比较,缺氧复氧组HUVECs存活率显著降低但凋亡率显著增高(P<0.01)且FKN mRNA和蛋白质表达也显著增高(P<0.01);与缺氧复氧组比较,LiCl 5、10 mmol/L组HUVECs存活率显著增高但凋亡率显著降低(P<0.01)且FKNmRNA和蛋白质表达也明显降低(P<0.05)。结论:缺氧复氧上调FKN表达诱导HUVECs损伤(存活率降低、凋亡率增加);LiCl预处理能够下调FKN表达,显著减轻缺氧复氧导致的HUVECs损伤。     

NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）凋亡的影响。方法 构建NHE-1核酶基因逆转病毒载体,转染体外培养的大鼠PASMC,应用半定量RT-PCR法（sqRT-PCR）测定细胞内NHE-1 mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测（TUNEL法）观察细胞凋亡情况。结果 转染NHE-1核酶基因的细胞,NHE-1 mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低,细胞凋亡率显著增加,电镜示细胞凋亡,凋亡小体形成。结论 NHE-1核酶基因转染可通过NHE-1抑制、细胞内酸化,显著诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。     

TG2对缺氧条件下骨肉瘤MG－63细胞凋亡的影响

目的：探讨TG2对缺氧型骨肉瘤MG－63细胞凋亡的影响。方法构建骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型,共分为4组,单纯缺氧组：细胞培养在缺氧培养箱中;常氧组：细胞培养在常规氧浓度下;TG2 siRNA缺氧组：细胞先转染TG2 siRNA,接着培养于缺氧培养箱中;对照siRNA缺氧组：细胞先转染对照siRNA,接着培养于缺氧培养箱中。各组骨肉瘤MG－63细胞培养6、12、24、48和72 h,观察在缺氧培养条件下TG2对骨肉瘤MG－63细胞caspase－3表达和活性的影响,细胞浆和细胞核中细胞色素C含量的变化和细胞凋亡情况。 TG2活性使用微量滴定板法检测,TG2的mRNA转录水平使用qPCR检测,并采用免疫印迹（western blot）检测胞浆和胞核内caspase－3、TG2以及细胞色素C表达和分布情况;采用免疫组化（ SP法）分析细胞内TG2蛋白的分布情况,细胞凋亡率通过流式细胞仪检测。结果与常氧组比较,对照siRNA缺氧组和单纯缺氧组的TG2 mRNA、蛋白表达以及活性均显著提高（P＜0.01）,在不同时间点差异有统计学意义;但caspase－3活性并未显著提高。然而胞浆内细胞色素C蛋白以及caspase－3的表达显著提高,细胞凋亡率轻度提高。与对照siRNA缺氧组比较,TG2 siRNA缺氧组的胞浆内细胞色素C蛋白表达水平以及caspase－3的活性显著改善（P＜0.01）,细胞凋亡率也相应提高（P＜0.01）。结论缺氧环境下,MG－63骨肉瘤细胞的TG2 mRNA、蛋白表达以及活性水平均显著上升,并随缺氧时间延长而逐步升高。 TG2可以阻止细胞核内细胞色素C向胞浆释放,进而抑制caspase－3的表达及活性,降低肿瘤细胞的凋亡率。     

Canstatin基因表达载体的构建及其生物学效应研究

目的　构建可表达人血管生成抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,探索canstatin对人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)和人肺腺癌A5 49细胞株的生物学效应。方法　RT PCR法从胎儿肝组织中获取canstatincDNA全长 ,并将其克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上。阳离子脂质体介导该重组载体转染HUVE细胞系、A5 49细胞株。RT PCR法检测其对canstatinmRNA的表达。台盼蓝拒染法活细胞记数 ,3 H TdR掺入法检测细胞增殖 ,TUNEL法检测细胞凋亡 ,流式细胞术检测细胞周期。结果　成功构建pCMV Script Cans真核表达重组载体 ,并在转染该表达载体的A5 49及HUV EC C细胞株中均检测到canstatinmRNA的表达。HUV EC C细胞株pCMV Script Cans载体转染组比空载体组 3 H TdR掺入量明显减低(P <0 0 1) ,细胞凋亡率明显增加 (P <0 0 1) ,A5 49细胞株转染组与空载体组 3 H TdR掺入量无显著差异 (P >0 0 5 ) ,细胞凋亡率无显著差别 (P >0 0 5 )。结论　pCMV Script Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达canstatin ,并抑制内皮细胞增殖 ,诱导内皮细胞凋亡 ,但对肿瘤细胞没有直接抑制作用。     

含hNIS报告基因的乏氧调控重组质粒的构建及其功能鉴定

目的构建乏氧应答启动子调控的人钠/碘共同转运体（hNIS）报告基因重组质粒,为实体瘤微环境乏氧的实时监测提供研究基础。方法合成乏氧反应元件（HRE）的核苷酸片段,克隆入pGL3-promoter,构建为pGL3-promoter-5×HRE载体。然后将扩增的hNIS基因插入pGL3-promoter-5×HRE载体中,构建为pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒并进行测序验证。以DMSO处理组作为对照,CoCl_2处理HEK293细胞模拟乏氧;将经验证的pShuttle-NIS质粒转染HEK293乏氧细胞,同时将构建的pcDNA3.1-HIF-1α质粒和pShuttle-NIS质粒按照3：1比例转染HEK293细胞,转染空质粒pcDNA3.1和pShuttle-NIS质粒组作为对照。通过qRT-PCR法检测hNIS基因表达的变化。并用高锝酸盐（~（99m）TcO_4~-）处理双质粒共转染的HEK293细胞,洗脱游离~（99m）TcO_4~-后通过γ计数器采集细胞放射性计数,检测所表达NIS蛋白的功能。结果克隆的基因产物与预期一致,序列无碱基的突变。共转染HIF-1α质粒组及转染pShuttle-NIS的CoCl_2处理组,其hNIS mRNA的表达量显著高于转染空质粒及DMSO处理组（均P〈0.01）。共转染HIF-1α质粒组细胞的~（99）TcO_4~-摄取率显著高于空质粒对照组（P〈0.01）。结论 pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒转染后能介导细胞摄取~（99m）TcO_4~-,为微环境细胞乏氧的核素显像提供实验依据。     

缺氧对肺成纤维细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的观察不同缺氧时间对肺成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法原代培养的人肺成纤维细胞在缺氧(37℃、5%CO2、5%O2、90%N2)条件下分别孵育0、1.5、3、6及12 h,同时用抗CTGF抗体干预的人肺成纤维细胞在缺氧条件下培养12 h。RT-PCR法测定细胞CTGF mRNA、基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA表达情况,ELISA法测定细胞培养上清液CTGF、MMP9的浓度。结果缺氧刺激肺成纤维细胞CTGF mRNA高表达出现在1.5 h,并保持一相对平台至6 h,12 h开始下降。MMP9 mRNA在缺氧1.5 h出现高表达,并保持持续增高的趋势。ELISA结果证实CTGF与MMP9一样其峰浓度在缺氧12 h,用抗CTGF抗体干预的成纤维细胞组较未干预组表达MMP9量明显减少。结论缺氧可刺激人肺成纤维细胞高表达CTGF;缺氧可能是通过刺激成纤维细胞高表达CTGF,进而调节细胞分泌MMP9的量,参予细胞外基质沉积和气道重构。     

缺氧状态下丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1在胃癌细胞系SGC7901中的过表达及其意义

目的　探讨丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1　 (MKP 1)在缺氧胃癌细胞系SGC790 1中的表达及对缺氧诱导因子 1(HIF 1)的影响。方法　采用半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Western印迹检测MKP 1在常氧及缺氧状态下胃癌细胞系SGC790 1中的表达 ;借助DNA重组技术构建MKP 1基因的正义真核表达载体 ;利用脂质体将正义真核表达载体和空载体转入SGC790 1细胞 ;双荧光素酶报告基因 (DualLuciferaseReporter,DLR)检测系统检测荧光素酶活性并采用ELISA法检测SGC790 1细胞培养上清血管内皮生长因子 (VEGF)的变化。结果　 (1)半定量RT PCR和Western印迹结果提示 ,MKP 1在胃癌细胞系SGC790 1中表达 ,缺氧时其表达上调 ;(2 )分别将MKP 1正义真核表达载体和pcDNA3.1空载体瞬时转入SGC790 1细胞 ;转染 4 8h后 ,缺氧 12h磷酸化HIF 1α在正义真核表达载体转染细胞 (SGC790 1 MKP 1)中的表达低于空载体转染细胞 (SGC790 1 空载体 )和未转染细胞(SGC790 1)。 (3)报告基因试验显示常氧情况下 3、6和 12h荧光素酶活性在SGC790 1细胞、SGC790 1 空载体细胞和SGC790 1 MKP 1细胞中差异无显著意义 (P >0 .0 5 ) ;缺氧情况下 ,SGC790 1 MKP 1细胞中荧光素酶活性在 3、6和 12h均明显低于SGC790 1细胞和SGC790 1 空载体 (P <0 .0 1)     

pEGFP-Ngb重组体的构建及其在SY5Y细胞中耐低氧的作用

目的构建pEGFP—Ngb荧光表达载体并研究其在缺氧条件下SY5Y细胞中的功能。方法小鼠NgbeDNA被亚克隆进pEGFP—N1载体，重组载体转染SY5Y细胞，通过双苯并咪唑染料（Hoechest）和碘化丙啶（PI）染色观测细胞在低氧条件的抗缺氧作用。结果成功构建pEGFP—Ngb荧光表达载体，表达Ngb的SY5Y细胞在低氧条件下的存活率增加。结论Ngb在低氧条件下对SY5Y细胞存活可能具有重要作用。     

乏氧对人口腔鳞状细胞癌细胞中叉头蛋白P3表达的影响及其机制

目的：观察乏氧对人口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中叉头蛋白P3（FOXP3）表达的影响,阐明乏氧调控FOXP3表达的表观遗传学机制。方法：选取人OSCC细胞株FaDu和OECM-1细胞,常氧和乏氧条件下培养18h。采用实时定量PCR方法检测细胞中FOXP3 mRNA的相对表达水平,Western blotting 法检测FaDu和OECM-1细胞中FoxP3蛋白表达水平,染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）法检测FOXP3基因启动子上组蛋白修饰H3K4乙酰化（H3K4ac）、H3K4三甲基化（H3K4me3）和H3K27三甲基化（H3K27me3）水平。采用组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）基因沉默的FaDu细胞,以实时定量PCR和ChIP-qPCR法检测FaDu细胞中HDA3 mRNA相对表达水平和FOXP3mTNA表达抑制率。结果：与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3 mRNA相对表达水平均明显降低,分别下降65.6%（P<0.01）和75.7%（P<0.01）;Western blotting检测,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3蛋白表达水平明显低于常氧条件下;染色质免疫沉淀实验,与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu细胞中FOXP3基因启动子上的H3K4ac和H3K4me3水平明显降低（P<0.01）,而H3K27me3水平无明显差异。与无HDAC3基因沉默的FaDu细胞比较,HDAC3基因沉默的FaDu细胞中缺氧诱导的FOXP3启动子上H3K4ac和H3K4me3表达抑制率明显降低（P<0.05）,缺氧诱导的FOXP3mRNA相对表达抑制率降低（P<0.05）。结论：乏氧可通过HDAC3介导的FOXP3基因启动子上H3K4ac水平下调而抑制OSCC细胞中FOXP3的表达。     

缺氧时前列腺间质细胞生长类激素受体的表达

目的观察缺氧条件下前列腺间质细胞WPMY-1体外培养细胞膜表面生长类激素受体表达的变化。方法 WPMY-1在缺氧或有氧环境中体外培养。接种后4,8,12,24,48 h分别用RT-PCR和免疫组化法检测其细胞膜表面生长类激素受体[表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growthfactor receptor,FGFR),转化生长因子受体(transforming growth factor receptor,TGFR),胰岛素样生长因子受体(insulin-likegrowth factor receptor,IGFR),血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)]基因和蛋白表达。结果较有氧环境,缺氧条件下WPMY-1细胞膜表面各类生长因子受体表达均增加,以EGFR为例,缺氧培养4 h后EGFR mRNA为0.34±0.04,略高于有氧条件下的0.29±0.01,但两者比较差异无统计学意义(P=0.149);此后观察时间点缺氧条件下细胞EGFR mRNA表达均显著高于有氧条件下。免疫组化显示缺氧条件培养4 h后细胞膜表面EGFR阳性表达为(7.11±0.31)/200个细胞,显著高于有氧条件的(6.00±0.29)/200个细胞(P=0.011),此后观察时间点除12 h差异无统计学意义外(P=0.166),缺氧条件下细胞EGFR蛋白表达均显著高于有氧条件下。结论缺氧可上调前列腺间质细胞膜表面上述各类生长因子受体表达。     

缺氧诱导滋养细胞转化生长因子3β表达及机理的实验研究

【目的】探讨低氧对滋养细胞转化生长因子-3β(TGF- 3β)的表达的诱导作用,以及缺氧诱导因子1(HIF -1)对TGF -3β表达的调控作用。【方法】滋养细胞来源的BeWo细胞系分4组培养:正常对照组、缺氧组、HIF- 1α反义组和HIF -1α正义组。HIF -1α反义组和HIF -1α正义组先加入HIF -1α寡核甘酸,常氧条件培养6h ,再低氧条件培养4 8h。4 8h后,收集细胞,实时定量PCR方法检测TGF- 3β和HIF -1αmRNA表达水平,Westernblot方法检测TGF- 3β和HIF 1α蛋白表达水平。【结果】与正常对照组相比,缺氧组的HIF -1αmRNA和蛋白表达增加,TGF- 3βmRNA和蛋白表达也升高;与HIF- 1α正义组比较,HIF- 1α反义组HIF -1αmRNA和蛋白表达降低,TGF- 3βmRNA和蛋白表达也下降。【结论】缺氧可以诱导滋养细胞TGF- 3β表达,并且缺氧对TGF- 3β表达的诱导作用可能通过HIF 1调控。     

辣根过氧化物酶/吲哚三醋酸酶前药对鼻咽癌细胞的杀伤作用

目的研究adv5.oriP.HRP对鼻咽癌细胞靶向性转染和HRP/IAA对鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法将adv5.oriP.HRP感染C666-1,KS1和CNE-2Z细胞,加入IAA,用MTT法评估细胞杀伤效果。建立乏氧有氧条件,检测HRP/IAA在乏氧状态下鼻咽癌细胞的杀伤能力及旁观者效应。结果adv5.oriP.HRP能靶向性在EBV阳性的鼻咽癌细胞内高效转染和表达。HRP/IAA对鼻咽癌细胞有强大的杀伤作用,在一定范围内杀伤能力随孵育时间和病毒载体及前药的浓度增高而增加。在乏氧状态下,HRP/IAA有同样的杀伤能力。当感染细胞占总细胞的10%左右时,65%的肿瘤细胞死亡,当比例达到20%时,90%以上的细胞死亡,显示HRP/IAA有很强的旁观者效应。结论adv5.oriP.HRP能在EBV病毒阳性的细胞内靶向性表达;HRP/IAA在乏氧和有氧状态下均有强大的杀伤能力和旁观者效应。adv5.oriP.HRP/IAA是理想的病毒介导的酶前药基因组合。     

缺氧诱导因子1α调控人肺腺癌瘦素表达机制的初步研究

目的 探讨低氧条件下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对人肺腺癌瘦素基因的调控作用及其机制.方法 采用免疫组织化学方法检测42例肺腺癌患者手术切除癌组织中HIF-1α和瘦素的表达,以其中16例患者的癌旁组织为对照.人肺腺癌A549细胞株分别经不同时间低氧处理(低氧0、12、24、48 h组)和不同浓度(0、5、10、20 μmol/L)HIF-1α抑制剂GL331+低氧处理,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞HIF-1α和瘦素mRNA的表达,蛋白质印迹法检测HIF-1α和瘦素蛋白的表达.结果 肺腺癌和癌旁组织中HIF-1α表达阳性率分别为57.1%和18.8%(P<0.01),瘦素表达阳性率分别为69.0%和25.0%(P<0.01).低氧0、12、24、48 h组A549细胞中HIF-1α蛋白表达水平分别为0.314±0.030、0.552±0.027、0.743±0.015、0.799±0.010,瘦素mRNA分别为0.144±0.009、0.336±0.017、0.524±0.013、0.671±0.021,瘦素蛋白分别为0.398±0.016、0.633±0.036、0.796±0.008、0.942±0.088,各低氧组均明显高于低氧0 h组(均P<0.01);HIF-1αmRNA表达不随低氧时间的延长而变化(P>0.05).GL331抑制HIF-1α转录后再给予低氧处理,A549细胞中HIF-1α、瘦素mRNA及蛋白表达均随GL331浓度升高而逐渐受抑,不同浓度组均明显低于0 μmol/L组(P<0.01).结论 瘦素的表达水平随肺腺癌细胞低氧信号的加强而上调,并受HIF-1α的调控.