大白菜CMS96细胞质雄性不育分子特性研究

大白菜CMS96细胞质不育系是由大白菜株系与甘蓝型油菜细胞质不育源杂交、多代回交后获得的。该不育系生长势旺、不育性稳定,不育度和不育株率均为100%,蜜腺正常,在大白菜杂种一代生产中具有广阔的应用前景。为了定位大白菜CMS96细胞质不育所属的类型和获得其不育有关的特异序列,依据atp9、coxI、orf138和orf224保守序列设计4对引物,对3组11份大白菜材料线粒体DNA进行PCR扩增,每组材料内包含同核异质PolCMS、OguCMS、CMS96三种大白菜不育系和一种共用保持系。结果表明,atp9和coxI引物在所有材料中均有扩增产物,供试材料间没有差异;而orf138和orf224引物扩增产物存在差异。orf138引物仅在全部OguCMS和CMS96不育系中扩增出309bp特异带,而保持系和PolCMS不育系没有扩增产物;orf224引物仅在所有PolCMS中扩增出689bp特异带,而保持系、OguCMS和CMS96不育系没有扩增产物。同时,对保持系和不育系花组织mRNA进行RT-PCR分析,进一步验证了orf138和orf224引物扩增产物的特异性和一致性。同源性分析结果表明,利用orf138引物所获得的309bp大白菜mtDNA特异片段均与萝卜OguCMS、甘蓝型油菜OguCMS萝卜体细胞杂种所具有的Oguorf138高度同源,二者有172个核苷酸完全相同,有58个氨基酸完全相同;orf224引物所获得的689bp大白菜mtDNA特异片段与甘蓝型油菜的Polorf224高度同源,二者有677个核苷酸完全相同,有225个氨基酸完全相同,同源性均达到100%。初步认为大白菜OguCMS和CMS96不育系具有相似性,OguCMS萝卜所具有的orf138是导致二者不育的原因;Pol甘蓝型油菜所具有的Polorf224是导致大白菜PolCMS不育的原因。     

一种紫色大白菜细胞质不育系的分子鉴定

为了获得紫色大白菜细胞质不育系的特异序列,鉴定该不育系所属的不育类型,应用设计的 orf138上、下游引物PCR扩增6份材料:紫色大白菜CMS不育系,保持系07-721,杂交F1,3个回交BC1单株BC1-1、BC1-2和BC1-3.对获得的差异片段进行克隆、测序,同源性比较.结果表明,在紫色大白菜CMS不育系、杂交F1、3个回交BC1单株上均扩增到309 bp的特异产物,而保持系07-721没有扩增产物.测序和同源性比对结果表明,紫色大白菜CMS的orf138与萝卜Ogura不育系的orf138、芸薹属作物与萝卜Ogu CMS体细胞杂种的orf138同源性均达到99%,E值为2e-155.证明了紫色大白菜CMS不育系为一种改良的Ogura萝卜细胞质不育系,同时初步探讨了该不育系和紫色基因的应用前景.     

大白菜线粒体DNA提取及细胞质雄性不育系RAPD分析

提取高质量线粒体DNA(mtDNA)是研究大白菜细胞质雄性不育系不育分子特性的前提。以大白菜绿色叶片为试验材料,应用一种省时、简便、操作步骤少的方法,快速获得3组11份大白菜的mtDNA(包括保持系、Ogu CMS、Pol CMS和CMS96细胞质雄性不育系)。试验中不需要加入DNase I酶消化核DNA,提取的mtDNA质量较好;同时,采用RAPD技术,对11份大白菜mtDNA进行多态性分析,获得了与大白菜Ogu CMS和CMS96不育系相关的差异片段10条,与大白菜Ogu CMS不育系相关的差异片段3条。初步证实:大白菜CMS96和大白菜Ogu CMS不育系既有相似性又存在差异性。     

与大白菜细胞质不育相关RAPD特征片段的克隆和序列分析

为了研究和获得大白菜细胞质不育系和保持系线粒体DNA的多态性,选用153个RAPD随机引物,对3套材料,每套中包含不同来源、同核异质的大白菜细胞质不育系（Pol-CMS、Ogu-CMS和CMS96）和保持系线粒体DNA进行RAPD分析。结果表明,有4个RAPD随机引物可以在全部Ogu-CMS和CMS96不育系中扩增出特异带,有1个随机引物仅在所有Ogu-CMS不育系中扩增出特异带;同时将OPAH16随机引物扩增的与不育相关的特异带进行了克隆和测序。结果表明,所获得的特异片段均与拟南芥和甘蓝型油菜的线粒体基因组序列部分同源,但与已发表的不育基因序列没有同源性。由这5个序列推导出的蛋白质与拟南芥中的一种未知功能蛋白AtMg00760（ORF109b）具有部分同源性。这5个序列的可能功能正在验证中。     

烟草ATP合酶F_0部分4个亚基基因转录本编辑位点分析

RNA编辑是高等植物线粒体基因转录后表达调控的一种重要方式。为探究ATP合酶F_0部分的4个亚基基因与植物雄性不育性的关系,本研究以3个烟草雄性不育系(MS中烟90、MS云烟85和MS K326)及其同型保持系为供试材料,比较分析atp6、atp9、orf25和orf B线粒体基因转录本的编辑位点。结果表明,orf25和orf B基因转录本在不育系和保持系中发生的编辑位点是一致的。atp6基因在不育系中未发生编辑,在保持系中共有6处发生了RNA编辑。与保持系相比,atp9基因在不育系中除8处共同的C→T编辑外,还缺少2个C→T的特异编辑位点,其中1个导致氨基酸类型的改变。推测不育胞质因缺少特异的线粒体基因转录本编辑而导致烟草的细胞质雄性不育。     

大白菜胞质雄性不育线粒体基因特异分子RAPD标记及克隆

用随机引物对大白菜细胞质雄性不育系及其保持系线粒体DNA的RAPD分析,在不育系与保持系的线粒体基因组间存在明显的差异,用引物S259在不育系中扩增并克隆得到特异片断(mt)S259~600bp,序列分析表明该片断与油菜线粒体基因NADH脱氢酶第四亚基序列有部分相似性,片段与雄性不育的关系还需进一步研究。     

大白菜细胞质雄性不育特异RAPD标记的筛选

根据近等基因系分析原理,以大白菜细胞质雄性不育系CMS-2及其保持系B-2为材料.对大白菜细胞质雄性不育基因及其保持基因进行RAPD标记研究。引物S391在不育系中有特异性扩增,得到一条约700bp的特异片断;引物S425在保持系中有特异性扩增,得到一条约600bp的特异片,分别命名为S391-700bp、S425-600bp。采用Blastn进行核苷酸同源序列比较,结果发现S391-700bp存在一个开放阅读框架,这一开放阅读框架与植物叶绿体丝氨酸乙酰基转移酶DNA部分片段有很高的同源性;S425-600bp是新发现的一段DNA序列。根据测序结果设计特异引物,结果表明本研究所获得的两个标记片断都能确定其特异性。     

甘蓝细胞质雄性不育相关基因orf138的分子特性分析

为了研究甘蓝雄性不育机制,根据萝卜CMS相关基因orf138的序列信息,设计特异引物,并在甘蓝不同类型不育系和保持系中鉴定PCR产物的稳定性。随后利用Tail-PCR技术,扩增获得此基因的侧翼序列并进行了生物信息学分析。结果表明在甘蓝不育型材料中,能够稳定扩增出300 bp左右的单一条带,而在其他细胞质不育类型和可育材料中均未扩出条带,经多次验证结果稳定可靠。甘蓝中orf138的上下游侧翼序列有效碱基1789 bp,通过生物信息学分析,获得包括起始密码和终止密码的orf138的完整序列共417 bp。同源性比对结果显示：与甘蓝型油菜﹑白菜和萝卜的orf138片段具有高度保守性。分析侧翼序列表明甘蓝orf138的3’端是由ORF83、trnfM、ORF125等基因片段构成的一个复杂序列。获得了甘蓝OguCMS特异的分子鉴定标记,明确了orf138在甘蓝线粒体中的位置,以上结果为甘蓝雄性不育的进一步研究奠定良好的基础。     

结球甘蓝细胞质雄性不育(CMS)类型的分子鉴定

本研究以高代回交转育获得的6个不育率和不育度均达100%且遗传稳定的结球甘蓝胞质雄性不育系为材料,通过对orf138与orf222基因的特异扩增发现,所鉴定的24个株系64个单株结球甘蓝CMS植株中59个单株既含有orf138基因,也有orf222基因.两种基因共存的结果暗示,该类CMS可能是ogura和nap两种类型的杂合体.进一步的序列分析结果表明,6个结球甘蓝CMS中所扩增获得的orf138基因与来自萝卜CMS的orf138基因序列完全相同;而除Bo134-2 CMS的orf222基因与甘蓝型油菜CMS orf222基因相比对有2个核苷酸差异外,其余5个CMS的orf222基因与甘蓝型油菜nap CMS orf222基因的相似性均为100%.其中,Bo134-2 CMS的orf222基因第191 bp的变异导致第64位氨基酸由精氨酸(R)突变成了赖氨酸(K).     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物，以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材，扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切，不育系产生1条保持系中没有的特异片段，其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记，该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。     

瓣化型胡萝卜胞质雄性不育相关片段的分离及序列分析

以128对引物组合对瓣化型胡萝卜胞质雄性不育系和保持系进行cDNA-AFLP分析，筛选与不育性相关的特异片段，对其中两个表达丰度较高的cDNA差异片段进行克隆测序。序列分析表明BY1949与拟南芥质子依赖性的类肽转运蛋白在核苷酸水平有87%的同源性，蛋白质水平有58%的同源性。BY2562与瓣化型胞质雄性不育（CMS）胡萝卜线粒体ATP8、ATP9、NAD6和cob-sp基因在核苷酸水平有99%的同源性，期望值为0.0；在蛋白质水平与CMS向日葵线粒体ORFB基因，COXIII 5'端未知蛋白YMF19以及CMS胡萝卜ATP-8，orfB-F1有97%的同源性；另外与胡萝卜orfB-CMS、orfB-F2、烟草orfB、油菜orf224、拟南芥线粒体orfB、萝卜orf158以及芥菜线粒体膜蛋白、甘蓝型油菜orf474也有90%以上的同源性。     

大白菜CMS96细胞质雄性不育系的特点分析

为了筛选和利用大白菜细胞质雄性不育系,对大白菜的3种细胞质雄性不育系：CMS96细胞质雄性不育系、波里马细胞质雄性不育系(Pol-CMS)和萝卜细胞质雄性不育系(Ogu-CMS)及其相应的保持系进行了主要植物学性状的比较研究。结果表明：Ogu-CMS存在多代转育后植株长势退化、杂交优势差,Pol-CMS存在育性受环境条件影响等缺点,而CMS96细胞质雄性不育系则克服了二者的缺点。另外,CMS96细胞质雄性不育系早期的晚抽薹性比保持系强、杂交种子的产量比保持系杂交种子产量高。CMS96细胞质雄性不育系不仅不育性稳定,多代回交不退化,而且杂交优势强,繁种产量高,表现出了广阔的育种应用前景。     

一个白菜型油菜细胞质雄性不育的遗传研究

１９９３年春在白菜型油菜品种“浠水白”中发现了几株雄性不育株,遗传研究结果表明,“浠水白”雄性不育株为细胞质雄性不育,所有调查过的白菜型油菜品种（系）均具有这种雄性水育的保持系。与ｐｏｌ ＣＭＳ和ｎａｐＣＭＳ的保持系和恢复系的测交结果表明,“浠水白”雄性不育与ｎａｐ ＣＭＳ具有相同的恢保关系,与ｐｏｌ ＣＭＳ具有完全不同的恢保关系。ＥｃｏＲⅠ,ＨｉｎｄⅢ,ＰｓｔⅠ和ＳａｌⅠ四种限制性内切酶的线粒体     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针，对NCa不育系、保持系和可育F1幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rnn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F1中的转录没有差异，只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1．1、0．9和0．6kb，orf139检测到0．8和0．6kb2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0．6kb转录本，而在可育F1中检测到0．6和1．2kb的转录本。NCaCMS不育的形成可能与orf222、orf39和atp9基因的表达有关。讨论了恢复基因在F1育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

油菜胞质不育类型相关基因研究进展

细胞质雄性不育在油菜杂种优势利用中具有重要作用,研究细胞质雄性不育的不育机理对有效利用杂种优势,实现三系配套及创造强优势组合具有重要意义。介绍Ogu CMS,Pol CMS,Nap CMS等目前国际上主要的甘蓝型油菜细胞质雄性不育类型,综述了线粒体基因组上与CMS性状相关基因的位点或片段的最新研究进展,并讨论当今学术界有关CMS产生机理的主要论点。