柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白3C表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化柯萨奇病毒(CVB5)非结构蛋白3C,免疫雄性大鼠制备多克隆抗体.方法 通过酶切质粒获取3C基因序列,构建到原核表达系统大肠埃希菌中诱导表达重组的3C蛋白,使用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,重组的3C蛋白作为抗原,免疫雄性SPF级大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价并Western印迹检测抗体特异性,用该抗体检测病毒在细胞内的复制.结果 构建了重组表达载体命名为3C-pET-28a,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达重组3C蛋白.ELISA测定制备的多抗血清效价为1:500 000,Western印迹检测在EV71、CVA16中都有交叉反应,并确定病毒感染细胞后24 h开始复制.结论 实验成功地利用原核表达系统表达柯萨奇病毒非结构蛋白3C,为进一步研究柯萨奇病毒的感染机理以及疫苗制备提供了基础.     

SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的：克隆表达SARS-CoV S1蛋白，构建SARS基因疫苗。方法：从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1蛋白的编码序列，将该序列克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western blot检测S1蛋白的表达。结果:PCR方法扩增出2000bp左右的基因片段，插入pVAXl构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为SARS-CoV Tor2株S1蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoV S1蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

柯萨奇病毒A16型2 B基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及其特性鉴定

目的：构建柯萨奇病毒A16的2B基因的酵母诱饵表达载体,用于筛选与2B相互作用的蛋白。方法 PCR扩增2B全序列,克隆入pGBKT7?BD,将构建好的 pGBKT7?2B转化到酵母细胞 Y2HGold;用Western印迹分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应。结果成功克隆了pGBKT7?2B并转化至Y2 HGold中,转化细胞Y2 HGold [pGBKT7?2B]可以表达诱饵蛋白2B,2B蛋白对转化细胞无细胞毒性和自激活效应。结论成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7?2B,可用于酵母双杂交筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白。     

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体.方法 以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的 基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定.结果 人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL.结论 成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础.     

PDCD4重组慢病毒载体的构建、包装及其对前列腺癌细胞增殖的影响

目的构建表达程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的慢病毒表达载体,建立能够稳定表达目的基因的前列腺癌PC3细胞亚株。研究PDCD4分子对前列腺癌细胞增殖的影响。方法利用PCR扩增PDCD4编码区片段,克隆入pENTRA-3C入门载体,利用LR clonaseⅡ重组酶将目的基因片段转接入pLenti-6.3慢病毒表达载体并包装相应的慢病毒,以表达红色荧光蛋白mCherry的pLenti-6.3-mCherry慢病毒载体包装的慢病毒为对照,感染人前列腺癌PC3细胞,通过杀稻瘟素(blasticidin)筛选出能够稳定过表达PDCD4蛋白的细胞亚株。利用Western blot法检测PDCD4蛋白的表达量,MTT法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化。结果构建了重组慢病毒载体pLenti6.3-PDCD4。利用重组慢病毒表达系统筛选稳定过表达PDCD4蛋白的细胞亚株,并用Western blot法进行了验证。MTT法及平板克隆形成实验结果显示PDCD4高表达的PC3细胞亚株的增殖能力受到抑制。结论成功构建了表达PDCD4分子的慢病毒表达载体,筛选出稳定表达PDCD4的PC3细胞株。过表达的PD-CD4分子可以显著抑制PC3前列腺癌细胞的增殖。     

质粒型甲病毒复制子载体系统的构建及其功能鉴定

目的 构建质粒型甲病毒复制子载体系统,并对其功能进行鉴定.方法 在XJ-160病毒感染性cDNA克隆的基础上,将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增,分步克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,并用多克隆位点序列替代病毒的结构基因构建XJ-160病毒质粒型复制子载体.将病毒核蛋白基因及包膜糖蛋白基因分别克隆至pVAX1 CMV启动子下游构建载体的两个辅助质粒.通过绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因的表达检验该质粒型载体系统的功能特性.结果 成功构建了包括复制子载体和辅助质粒的质粒型甲病毒复制子载体系统,且该复制子载体系统可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因.结论 本研究构建了能够表达外源基因的质粒型甲病毒复制子载体系统,为目标基因表达、重组病毒颗粒制备等奠定了基础.     

人β防御素4基因的合成及克隆载体的构建

目的：合成人β防御素4（HBD4）基因并构建其克隆载体.方法：根据GenBank中HBD4结构基因的序列, 设计合成了6条长度为32 ～60 bp的寡聚核苷酸片段, 用重叠延伸PCR法扩增合成HBD4 cDNA全长.PCR产物经双酶切后, 克隆入载体pMD18-T中, 并导入细菌中进行扩增.结果：HBD4基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、 测序分析证实, 合成的目的基因与设计的HBD4 cDNA的序列相一致, 并成功地克隆入克隆载体pMD18-T中.结论：用重叠延伸PCR法能方便、 准确地获得目的基因片段.重组克隆载体pMD18-T-HBD4 的获得, 为构建HBD4基因的表达载体并表达奠定了基础.     

我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究

目的 构建含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法 首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白Ⅰ/Ⅱ抗原区和4型病毒B5株E蛋白Ⅲ抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测定确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 构建的含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论 所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。     

面肩肱型肌营养不良症发病机制的研究进展

面肩肱型肌营养不良症,是一种常染色体显性遗传疾病,至今尚未找到其致病基因。大部分面肩肱型肌营养不良症患者和4q35区域3.3-kb的串联重复序列Z4D4的整倍缺失紧密连锁,几乎所有面肩肱型肌营养不良症患者,Southern杂交片段小于35 kb(少于11个D4Z4重复序列),而正常人群该片段为350 kb(11-150个D4Z4重复序列)。通过分子生物学研究与生物信息学分析,在4q35区域内,排除了FRG1、FRG2、ALP、ANT1、DUX4、YY I、HMGB2及Nu-c lolin等几个可能的候选基因;有关肩肱型肌营养不良症发病机制的位置变异效应假说,需要更多的证据支持;另一假说认为,面肩肱型肌营养不良症患者,D4Z4区域内类似沉默子的序列与转录抑制复合物相结合,由于D4Z4的缺失,该复合物不能形成并导致D4Z4上游基因的过表达,有关基因的过表达通过某种不明机制导致FSHD疾病的发生;D4Z4的缺失使4qter在细胞核内的定位异常,使许多基因的表达不正常,从而引起一系列的病理变化,并最终导致FSHD疾病的发生,也是FSHD发病的可能性机制之一。FSHD的发病相关基因和发病机制的研究有待深入。     

肝素治疗纤溶酶原激活剂抑制物-1基因启动因子区-675 4G/4G基因型基因所致重复流产孕妇的疗效探讨

目的 探讨肝素(heparin)治疗纤溶酶原激活剂抑制物-1基因启动因子区-675 4G/4G基因型基因所致重复流产的疗效.方法 将56例反复性妊娠丢失患者(排除感染、内分泌、子宫附件、免疫等导致流产的其它因素,由纤溶酶原激活剂抑制物-1基因启动因子区-675 4G/4G基因型基因),就诊后一经诊断为妊娠即给分为两组,分别给予肝素治疗或不给予任何干预.观察两组的妊娠结局. 结果肝素治疗24例中,22例足月产(91.66%)、2例早产35.9±1.6w(33～37.6)并产出活婴(11.11%)、活产率100%.比对照组50% (12/24),差异有显著性(P＜0.01).结论 肝素对纤溶酶原激活剂抑制物-1基因启动因子区-675 4G/4G基因型基因所致重复流产孕妇的治疗效果显著.     

Genetic analysis of Huntington disease in Italy

Twelve Italian families with Huntington disease were tested with 10 probes known to be linked to the disease locus and able to detect polymorphisms at the following loci on chromosome 4: D4S10, D4S127, D4S95, D4S43, D4S115, D4S111, D4S90. The results confirmed the applicability of the linkage approach for presymptomatic diagnosis in Italian families. Positive lod scores were found between D4S10, D4S95, D4S43 and the disease, wherease D4S90 did not indicate significant linkage values. With the limitations due to the small size of the tested sample, no genetic heterogeneity was detected in the families examined for loci D4S10, D4S95/S127, D4S43.     

Hilar cholangiocarcinoma with extensive immunoglobulin G4 reaction

Immunoglobulin G4 (IgG4)-related disease (IgG4-RD) is a systemic fibroinflammatory disorder that can involve multiple organs. It is often challenging to distinguish IgG4-related sclerosing cholangitis (IgG4-SC) from cholangiocarcinoma because of overlap in their clinical findings. A 75-year-old man presented to a hospital for a detailed examination of the elevation of some biliary enzymes. Radiographic examination revealed segmental bile duct with wall thickening of the common hepatic bile duct, and dilation of the peripheral branches. Transampullary biopsy showed a non-specific inflammatory reaction with several IgG4-positive cell infiltrations. There were no signs of malignancy. The liver biopsy showed bile duct injury accompanied by IgG4-positive cell infiltration. We then performed bile duct biopsy and finally diagnosed the patient with cholangiocarcinoma. We should remember that the IgG4 reaction is neither completely sensitive nor specific for IgG4-RD and avoid resting solely on the IgG4 reaction to precisely distinguish IgG4-SC from cholangiocarcinoma.     

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.方法 构建原核表达质粒pGEX-5X-1-PIWIL4,转化大肠杆菌BL21,PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清.以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测PIWILA在各细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位.结果 成功构建原核表达质粒,表达并纯化PIWIL4蛋白.免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1:20 000,Western blot和免疫组化确定抗体具有高度特异性,并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位.结论 PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备,为进一步研究PIWILA的生物学功能奠定了基础.     

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.方法 构建原核表达质粒pGEX-5X-1-PIWIL4,转化大肠杆菌BL21,PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清.以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测PIWILA在各细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位.结果 成功构建原核表达质粒,表达并纯化PIWIL4蛋白.免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1:20 000,Western blot和免疫组化确定抗体具有高度特异性,并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位.结论 PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备,为进一步研究PIWILA的生物学功能奠定了基础.     

Severe limb malformations in 4p deletion

Severe limb anomalies with radial aplasia and hypodactylia are reported in a male newborn with 4p deletion syndrome. In apparent contradiction with previous reports, this finding indicates that the radial aplasia, as frequently observed in patients with ring chromosome 4 , seems to be more likely related to the 4p deletion, rather than to the 4q deletion.     

抗CD4及抗CXCR4抗体阻断HIV—1感染细胞作用的研究

为探讨抗ＣＤ４ 及抗ＣＸＣＲ４ 抗体在阻断Ｉ型人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－ １） 感染应用中的意义, 本文应用上述两种抗体分别与ＳｕｐＴ１ 细胞及人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ） 共培育, 以封闭ＨＩＶ－ １ 在上述细胞上的受体。然后, 以ＨＩＶ１ ＮＬ４３ 病毒株感染上述细胞, 通过测定感染细胞上清中ＨＩＶ－ １ 的Ｐ２４ 蛋白含量, 观察上述抗体对ＨＩＶ－ １ 感染细胞的阻断作用。结果显示, 无论是抗ＣＤ４ 或抗ＣＸＣＲ４ 的抗体单独应用或是两者联合应用, 均可明显地抑制ＨＩＶ－ １ 感染细胞的作用。该结果为今后开拓ＡＩＤＳ的抗体治疗提供了理论基础。     

类风湿关节炎T细胞亚群4-1BB的表达与其分泌TH1/TH2细胞因子的关系

目的探讨体外培养的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)T淋巴细胞上共刺激分子4-1BB的表达,及与其分泌T_H1/T_H2细胞因子的关系。方法应用流式细胞术检测体外培养的30例RA患者和20例正常对照者T细胞活化前后4-1BB的表达,并且应用ELISA方法检测培养上清液中IFN-γ、IL-4水平。结果RA患者CD4~ T和CD8~ T细胞表达的4-1BB明显高于正常对照组(表达百分率分别为18.56%±4.08%和10.33%±2.13%;1.24%±0.12%和0.87%±0.09%,P<0.01),经抗CD3单抗体外刺激后CD4~ T和CD8~ T细胞表达的4-1BB均显著高于活化前(表达百分率为33.21%±4.29%和21.35%±8.12%,P<0.01)。RA患者CD4~ T/CD8~ T比值明显升高,而且与4- 1BB~ CD4~ T细胞数呈正相关关系(r=0.84,P<0.01),RA患者T淋巴细胞培养液上清中IFN-γ、IL-4均高于正常对照组(P<0.05),经抗CD3单抗体外刺激后上清液中IFN-γ及Ib-4均明显高于活化前,以IFN-γ升高最为显著(P<0.01)。而且抗CD3单抗刺激前后4-1BB~ CD4~ T细胞数与培养上清液中IFN-γ水平均呈正相关关系(r=0.721,r=0.487,P<0.05)。结论类风湿关节炎患者T细胞表达的4-1BB在类风湿关节炎的发生发展中具有重要意义,4-1BB可能通过对CD4~ T细胞活化,促使T_H1细胞因子分泌,参与关节炎症和免疫损伤。     

4-1BB／4-1BBL在T细胞免疫应答及疾病发生中的作用

共刺激分子4-1BB和4-1BB配体（4-1BBL）属于肿瘤坏死因子／肿瘤坏死因子受体（TNF／TN—FR）超家族的重要成员,分别表达在活化的T细胞及树突状细胞（DC）上。4-1BB与4-1BBL相互作用产生的共刺激信号能够促进T细胞增殖、分化以及细胞因子的产生。4-1BB／4—1BBL信号途径在自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染等疾病的发生、发展过程中起着重要的免疫调节作用。干预调节4-1BB／4-1BBL信号途径有望为疾病的免疫治疗提供新的思路。