反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞

背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。结果与结论:①病毒滴度为1.9×108CFU/L。②对照组 BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P<0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。     

细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响

本实验探讨细胞因子SCF,IL-3和IL-6对基因转移效率的影响,为临床基因治疗提供可靠依据。以小鼠造血干细胞为靶细胞,应用包装细胞株PA317-GCGPXSN制备病毒上清,实施基因转移,采用FACS,GM-CFU,PCR和Southern blot方法测定基因转移效率。实验结果为:SCF,IL-3,IL-6单用或联合应用后,FACS测定的基因转移效率为0.07％-0.20％,GM-CFU测定的结果为20.4％-46.40％,阳性对照组测定的结果则分别为0.06％和10.92％。结论提示SCF/IL-3,SCF/IL-3/IL-6联合应用能显著提高基因转移效率。     

Ly49A 基因转染的淋巴细胞对H—2^d小鼠正常和肿瘤细胞杀伤活性的实验研究

目的观察Ly49A基因转染的C57BL/6小鼠的淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和4T1乳腺癌细胞杀伤能力的变化与差异。方法构建逆转录病毒表达载体pLXSN-Ly49A,经由PA317包装细胞包装后转染C57BL/6小鼠淋巴细胞。流式细胞仪检测Ly49A受体在转染后淋巴细胞上的表达率。MTT法检测转染后淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和4T1乳腺癌细胞的杀伤活性,以空载体转染和未转染的淋巴细胞作对照。结果Ly49A基因转染的C57BL/6小鼠的淋巴细胞24?h后Ly49A受体表达率为(46.67±0.35)%,空载体转染组为(18.73±0.85)%,未转染对照组为(19.60±0.27)％,其对BALB/c小鼠正常成纤维细胞的杀伤活性明显降低(抑制率22％～25%),对4T1乳腺癌细胞的杀伤活性无明显改变（P＞0.05）。结论转染Ly49A的C57BL/6小鼠淋巴细胞对BALB/c小鼠正常细胞的杀伤作用明显降低,但仍保留了对肿瘤细胞的杀伤活性,为解决异基因骨髓移植后移植物抗宿主病提供了实验依据。     

逆转录病毒载体介导的耐药基因在造血细胞中基因转导和表达的研究

本文对于逆转录病毒载体介导的基因转移方法中如何提高逆转录病毒滴度进行了研究。以磷酸钙共沉淀的方法转染包装细胞PA17,经氨甲蝶呤(MTX)10~(-7)mol/L筛选,扩增得到产病毒细胞株,经点杂交证实dhfr基因成功导入并产生病毒颗粒。混合细胞克隆PA317/pSPD产生的逆转录病毒滴度为(1.1-2.3)×10~3 cfu/ml。随MTX筛选浓度增加,产病毒细胞PA317/pSPD抗性增加。当培养基中MTX浓度由10~(-7) mol/L增加到10~(-6)mol/L时,逆转录病毒滴度增加了近10倍[(1.02-2.09)×10~4 cfu/ml]。结果显示可以通过增加MTX筛选浓度来提高含dhfr cDNA的逆转录病毒滴度。     

用单倍体相合小鼠FBL-3红白血病细胞株移植建立CB6F1小鼠红白血病模型

本研究探讨建立F1代单倍体相合小鼠FBL-3红白血病模型的可行性,并观察FBL-3细胞在小鼠体内的生物学特性。将FBL-3H2-d小鼠红白血病细胞经尾静脉分别接种给小鼠C57BL/6和CB6F1H-2b/d(C57BL/6×BALB/c),观察两种小鼠的生存时间和染色体变化,并对濒死小鼠的肝、脾、肺和肾进行病理检查,部分进行电子显微镜检查。分析骨髓和脾脏细胞染色体核型及MHC分子表达情况。结果表明:静脉接种103-107个白血病细胞的情况下,C57BL/6小鼠和CB6F1小鼠发病率分别为100%和92.5%;接种的细胞数量与存活时间呈线性关系;接种相同数量FBL-3细胞的CB6F1小鼠平均生存时间较C57BL/6小鼠延长。白血病细胞主要侵及肝、脾、骨髓、肺和肾组织,糖原染色阳性、氯醋酸染色部分阳性,过氧化物酶、碱性磷酸酶、丁酸染色均为阴性。电子显微镜观察到细胞内病毒样颗粒。脾脏和骨髓细胞染色体多数为非二倍体,且H-2b表达率升高,H-2d表达率降低。结论:经尾静脉接种FBL-3细胞可以建立CB6F1小鼠红白血病模型。     

构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景：转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的：探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法：分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论：慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%（P〈0.05）。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。     

在小鼠骨髓移植中CCR5与急性移植物抗宿主病的相关性研究

本研究评价供者CCR5在经过强化预处理的骨髓移植动物模型受者体内的作用,为今后的异基因造血干细胞移植的临床应用提供科学依据.经过致死剂量照射的BALB/c小鼠接受异基因C57BL/6小鼠的骨髓移植.根据回输的细胞不同实验分为4组:B6 CCR5 KO组,受者接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓和脾脏细胞;B6 WT组,受者接受野生型C57BL/6小鼠骨髓和脾脏细胞;B6 CCR5 KO BMC组,受者只接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓细胞;B6 WT BMC组,受者只接受野生型C57BL/6小鼠骨髓细胞.结果表明:较之B6 WT组,B6 CCR5 KO组小鼠以更快的速度死于急性GVHD;其受者体内的CD8+T细胞更大量的增殖;其T细胞恢复后产生更多的INF-γ和TNF-α并且由于其T细胞有丝分裂原刀豆素水平处于较高水平,从而进一步促进T细胞的增殖,提示CCR5的作用之一是下调参与排异反应的供者CD8+T细胞的增殖.组织学评价提示,移植剔除CCR5基因受者细胞的小鼠肾脏出现了病理损伤并且肝脏存在有更为严重的病理变化.结论:剔除CCR5基因的异基因骨髓移植使GVHD发病率的增加,供者CD8+T细胞在受者体内增殖增加以及肝肾损害加重,这提示CCR5在异基因骨髓移植中起着重要作用.     

在小鼠骨髓移植中CCRS与急性移植物抗宿主病的相关性研究

本研究评价供者CCR5在经过强化预处理的骨髓移植动物模型受者体内的作用，为今后的异基因造血干细胞移植的临床应用提供科学依据。经过致死剂量照射的BALB／c小鼠接受异基因C57BL／6小鼠的骨髓移植。根据回输的细胞不同实验分为4组：B6CCR5KO组，受者接受C57BL／6CCR5^-/-小鼠骨髓和脾脏细胞；B6WT组，受者接受野生型C57BL／6小鼠骨髓和脾脏细胞；B6CCR5KOBMC组，受者只接受C57BL／6CCR5^-/-小鼠骨髓细胞；B6、WT BMC组，受者只接受野生型C57BL／6小鼠骨髓细胞。结果表明：较之B6、WT组，B6CCR5KO组小鼠以更快的速度死于急性GVHD；其受者体内的CD8^＋T细胞更大量的增殖；其T细胞恢复后产生更多的INF-γ和TNF-α并且由于其T细胞有丝分裂原刀豆素水平处于较高水平，从而进一步促进T细胞的增殖，提示CCR5的作用之一是下调参与排异反应的供者CD8^＋T细胞的增殖。组织学评价提示，移植剔除CCR5基因受者细胞的小鼠肾脏出现了病理损伤并且肝脏存在有更为严重的病理变化。结论：剔除CCR5基因的异基因骨髓移植使GVHD发病率的增加，供者CD8^＋T细胞在受者体内增殖增加以及肝肾损害加重，这提示CCR5在异基因骨髓移植中起着重要作用。     

输入供体凋亡细胞对受体外周免疫耐受的影响

背景:预输注供者凋亡细胞能够诱导受者体内产生针对供者抗原发生的特异性免疫耐受,但其具体途径尚不清楚.目的:观察供体凋亡淋巴细胞输注后受体外周血细胞因子的变化.设计、时间及地点:细胞观察性实验,于2007-11/2008-05在南方医科大学附属珠江医院移植免疫实验室完成.材料:供体C57BL雄性小鼠14只,8～10周龄,受体Balb/c雄性小鼠50只,6～8周龄.方法:分离供体小鼠脾脏细胞,放置于紫外线灯距离20 cm处的摇床上照射1 h,紫外线诱导C57BL小鼠脾脏细胞凋亡.将受体Balb/c小鼠随机分为凋亡细胞组和活细胞组,分别将107个供体C57小鼠脾脏凋亡细胞、活细胞经尾静脉输注于受体小鼠.主要观察指标:输注后0,1,3,6,12 h经心脏采血,Luminex技术液态芯片法检测外周血白细胞介素1 β、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素10、白细胞介素12、粒细胞-巨细胞集落刺激因子、干扰素γ、肿瘤坏死因子变化.结果:只检测到白细胞介素6、白细胞介素10、白细胞介素12、粒细胞-巨细胞集落刺激因子、干扰素γ 5种细胞因子,其他细胞因子末测出.经紫外线诱导后小鼠脾脏细胞凋亡率达到93.86%.与0 h相比,外周血中干扰素γ和白细胞介素10分别在输注活细胞后6 h和3,6 h明显升高,其他细胞因子无明显变化.与0h相比,输注凋亡细胞1,3,6,12 h后,外周血中各细胞因子无明显变化.活细胞组输注后1 h白细胞介素6和输注后3,6 h白细胞介素10浓度高于凋亡细胞组,其他细胞因子差异不显著.结论:同种异源供者凋亡淋巴细胞输注对外周血细胞因子浓度无变化,提示其对受体外周免疫功能可能无明显影响,其诱导产生的免疫耐受可能主要在局部发挥作用.     

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力，利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK）基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN，采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞，G418筛选出抗性克隆，收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞，在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明；重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后，含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论：逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞，可作为介导T细胞基因转移的重要工具。     

Cellular basis of graft versus host tolerance in chimeras prepared with total lymphoid irradiation

BALB/c mice given allogeneic (C57BL/Ka) bone marrow cells after toal lymphoid irradiation become stable chimeras approximately 80% donor- type and 20% host-type cells in the spleen. The chimeras doe not develop graft vs. host disease (GVHD). Purified cells of C57BL/Ka origin from the chimeras mediated GVHD in lightly irradiated C3H (third party), but not in BALB/c (host-strain) mice. Thus graft vs. host tolerance in the chimeras could not be explained by complete immunodeficiency of donor-type cells, serum blocking factors, or suppressor cells of host (BALB/c) origin. Clonal deletion or suppression of lymphocytes reactive with host tissues remain possible explanations. The transfer of donor-type chimeric spleen cells to BALB/c recipients given 500-550 rad whole-body irradiation WBI led to stable mixed chimerism in approximately 50% of recipients. The cells were presumably acting as tolerogens because similarly irradiated BALB/c mice given (BALB/c X C57BL/Ka)F1 spleen or bone marrow cells also became stable mixed chimeras.     

致敏动物模型的建立及其对造血干细胞植入的影响

本研究目的是建立致敏的动物模型，探索致敏动物体内免疫功能的改变，并探讨致敏对造血干细胞植入的影响。经尾静脉分别输注不同数量的C57BL／6脾细胞（1×10^5、1×10^6、1×10^6，连续注射2次，间隔7天）于BALB／c小鼠，通过补体依赖淋巴细胞毒性实验、混合淋巴细胞反应和ELISA等方法检测致敏模型的免疫功能。致敏BALB／c模型经8Gy^60Coγ-线照射后通过尾静脉或骨髓腔移植1×10^7C57BL／6骨髓细胞，观察移植后生存情况。结果表明：致敏BALB／c模型均产生不同强度的供者反应性抗体，1×10^6及1×10^6连续注射2次，间隔1周的致敏组脾细胞体外增殖均明显高于正常小鼠。各组致敏模型小鼠经尾静脉注射C57BL／6骨髓细胞后，均于移植后第9—15天死亡，1×10^6连续注射2次，间隔1周的致敏BALB／c模型经骨髓腔注射骨髓细胞后亦于2周内死亡。结论：通过同种异基因的脾细胞输注建立不同致敏程度的动物模型，该致敏模型小鼠体内免疫功能的变化与致敏程度有关。脾细胞输注致敏使受者对供者造血干细胞产生排斥作用，而骨髓腔注射方法并不能改善植入。     

Ly49A转基因小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植后GVHD和GVL的作用

目的　观察Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠脾细胞对半相合异基因骨髓移植 (allo BMT)后移植物抗宿主病 (GVHD)和移植物抗白血病效应 (GVL)的影响。方法　经由逆转录病毒介导将Ly4 9A基因转染至C5 7BL 6小鼠的脾细胞 ;流式细胞仪检测Ly4 9A受体在转染后脾细胞上的表达率 ;以亲代C5 7BL 6H 2 b 小鼠为供者 ,以接种EL96 11红白血病细胞的 (BALB c×C5 7BL 6 )F1H 2 d b(CB6F1)小鼠为受者 ,预处理条件为全身照射 (TBI,6 0 Co照射 10 .5Gy) ,进行脾细胞混合骨髓细胞移植 ,建立半相合异基因急性GVHD模型并在该模型基础上观察Ly4 9A基因转染的脾细胞对GVHD和GVL的作用。结果　Ly4 9A基因转染的C5 7BL 6小鼠的脾细胞 2 4h后蛋白表达率为 (42 .2 0± 4 .87) % ,空载体转染组为(18.6 7± 2 4 8) % ,未转染对照组为 (18.73± 3.82 ) % ,在半相合异基因移植中 (C5 7BL 6 H 2b →CB6F1H 2d b) ,未进行移植的单纯照射组生存期为 (7.80± 3.36 )d ;环磷酰胺治疗组生存期为 (2 1.70±2 87)d ;脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.4 0± 6 .4 3)d ;空载体转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (2 9.10± 7.39)d ;Ly4 9A转染的脾细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 (45 .0 0± 12 .38)d ,较上述各组生存期明显延长 (P     

移植GM—CSF基因修饰的骨髓细胞对小鼠造血恢复的影响

探索粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰的骨髓细胞促进照射鼠骨髓移植后造血功能恢复的可行性。通过基因转移造血细胞进行骨髓移植的小鼠模型动态观察移植鼠外周血细胞数量、肝脾及骨髓形态学,CFU-S,CFU-GM及血清GM-CSF活性的变化。结果表明,实验组小鼠外周血白细胞与中性粒细胞计数,CFU-S及脾脏CFU-GM明显高于对照组(P<0.05),而各组间骨髓CFU-GM计数无显著性差异(P>0.05);组织学显示实验小鼠肝脾造血组织明显增多,而各组间骨髓象改变不大,并且血清GM-CSF活性也较对照组明显升高(P<0.01)。结论提示,给γ射线照射小鼠移植GM-CSF基因修饰的骨髓造血细胞能显著加快造血恢复的过程。