siRNA沉默HIF-1α基因对前列腺癌PC-3细胞多西紫杉醇化疗敏感性的影响

目的:探讨沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对前列腺癌PC-3细胞多西紫杉醇(docetaxel,DTX)化疗敏感性的影响。方法:实验分为PC-3组,PC-3+NCsiRNA组,PC-3+HIF-lαsiRNA组。用脂质体Lipofectamine2000将经过筛选证实有效的HIF-1αsiRNA序列和阴性NC siRNA序列转染PC-3细胞。待细胞转染或不转染后继续培养,根据实验要求时间点加入DTX。采用CCK-8法检测转染后96 h内各组细胞的生长增殖情况,流式细胞仪检测加DTX后48 h各组细胞的周期分布、凋亡率及多药耐药基因P糖蛋白(MDR/P-gp)的表达。结果:PC-3+HIF-1αsiRNA组肿瘤抑制率高于PC-3+NC siRNA组,尤以转染后48 h表现的较为明显;转染后48 h,PC-3+HIF-1αsiRNA组细胞存活率均明显低于PC-3组和PC-3+NCsiRNA组(P均0.01)。细胞周期分布变化,PC-3+HIF-1αsiRNA组较两对照组比较,G0/G1期细胞百分数较低,而G2/M期细胞百分数稍高(P均0.01)。细胞凋亡结果,PC-3+HIF-1αsiRNA组细胞凋亡率明显高于两对照组(P均0.01)。各组细胞MDR/P-gp表达无明显差异(P均0.05)。结论:沉默HIF-1α基因能增强DTX对前列腺癌PC-3细胞的生长抑制,通过调整细胞周期重新分布、诱导细胞凋亡,增加前列腺癌PC-3细胞对化疗的敏感性,而这一作用与MDR/P-gp无明显相关。     

自制纳米级超声微泡造影剂与脂质体基因转染效率的比较

目的 以GFP为目的 基因,比较自制纳米级超声微泡造影剂和脂质体的转染效率,探讨自制纳米级超声微泡造影剂作为基因载体的可行性.方法 噻唑蓝(MTT)比色法检测超声微泡浓度对HepG2的细胞毒性;取安全浓度的超声微泡造影剂和脂质体分别与4、8、16μg的PShut-tle-IRES-hrGFP-1质粒结合后转染HepG2细胞,24 h后利用荧光显微镜和流式细胞术检测并比较两者的GFP转染效率.结果 MTT法显示超声微泡造影剂浓度≤5%时对HepG2细胞生长无明显影响(P＜0.05);超声微泡造影剂能将GFP基因成功转运到HepG2细胞内并高效表达,微泡造影剂+8μg质粒组转染效率达(32.61±3.42)%;脂质体+4 μg质粒组的转染效率为(34.12±8.06)%,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 自制纳米级超声微泡造影剂能成功转运外源DNA进入细胞内,其转染效率与脂质体无明显差异.     

超声微泡介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用

目的 观察超声微泡(UM)介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤效率.方法 将HepG2接种在培养板中,随机分为以下5组:(A)空白对照组;(B)单纯质粒组;(C)超声微泡+质粒组;(D)超声+质粒组;(E)超声+超声微泡+质粒组.转染后24 h,荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光的表达,流式细胞仪检测各组细胞的转染效率,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染方法对HepG2活性的影响,Western blot法检测各组细胞的TK蛋白表达;转染后24h,各组细胞加入0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 mg/L共8个浓度梯度的前药更昔洛韦(GCV),72 h后MTr法检测各组细胞的存活率.结果 荧光显微镜下E组的绿色荧光强度明显高于其他各组;流式细胞仪检测基因转染率分别为0％、0.39％、0.61％、1.10％、36.00％,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测提示E组tk mRNA相对表达量为1.13,是其余各组的7～9倍,Western blot 条带灰度分析显示E组TK蛋白的明显高于其他各组(P＜0.05);转染方法对HepG2细胞活性无明显影响(P＞0.05);GCV浓度在50 mg/L以上培养72 h后,低频超声+超声微泡+质粒组细胞几乎全部被杀灭,存活率为0,杀伤效应最强(P＜0.05),其余各组几乎无杀伤作用.结论 超声破坏微泡造影剂可提高HSV1-TK基因在HepG2中的转染和表达,增强HSV1-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤效应,而超声辐照和微泡造影剂在转染过程中对细胞的活性无影响.     

基质交联分子1对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的:观察抑制基质交联分子1(STIM1)对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将携带STIM1基因的小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体STIM1-pGCSIL-GFP转染人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,3d后荧光倒置显微镜观察转染效率;1周后RT-PCR及Western印迹验证STIM1抑制表达有效性,并采用Western印迹检测PC-3细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,survivin、激活型Caspase-3的表达水平。结果:倒置显微镜观察发现PC-3细胞病毒转染效率80%。转染1周后,RT-PCR及Western印迹显示STIM1被有效抑制。抑制STIM1表达后,对照组Bcl-2/Bax比率为1.24,干扰组PC-3细胞Bcl-2/Bax比率为0.31,比率显著下降;干扰组PC-3细胞survivin表达明显降低,相对表达量为对照组的0.14倍;Caspase-3裂解激活相对表达量为对照组的1.52倍(P0.05)。结论:STIM1在前列腺癌PC-3细胞中可视为致癌基因,抑制其表达可通过下调Bcl-2/Bax比率,降低survivin表达,激活Caspase-3级联通路,诱导细胞凋亡。     

探讨抑制水通道蛋白-1在人前列腺癌细胞中的表达对癌细胞凋亡的影响

目的:通过抑制水通道蛋白-1在前列腺癌PC-3细胞的表达,了解前列腺癌细胞的凋亡情况。方法:设计合成针对前列腺癌PC-3细胞AQP1基因的小干扰RNA并构建高效表达载体,脂质体法转染PC-3细胞,Western Blot检测AQP1蛋白表达的变化。结果:AQP1在前列腺癌PC-3细胞表达,针对AQP1基因siRNA高效表达载体能够抑制AQP1蛋白在PC-3细胞的表达,AQP1蛋白相对表达量为:转染组0.54±0.04,正常对照组0.82±0.08,差异有显著性(P<0.01);成瘤实验中转染组caspase-3的含量明显高于对照组,差异显著(P<0.05),AQP1的表达量与癌细胞的凋亡呈负相关。结论:通过抑制AQP1基因的表达,有效抑制了前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达,近而使癌细胞的凋亡增加。     

超声微泡介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因体外转染兔软骨细胞的研究

目的 观察超声介导下携白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因(IL-1Ra)的微泡体外转染兔软骨细胞的效率和表达.方法 体外分离培养兔软骨细胞,分为单纯质粒组(P)、微泡+质粒组(M+P)、超声+质粒组(U+P)和超声+微泡+质粒组(U+M+P),照射后48 h,荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测IL-1Ra基因的mRNA和蛋白表达,台盼兰染色检测细胞生存率.结果 U+M+P组转染效率较其他三组明显提高,为(11.6±1.0)%;且eGFP-C1-IL-1Ra质粒经超声微泡介导转染后可表达IL-1Ra的mRNA和蛋白.结论 超声微泡可介导IL-1Ra基因在兔软骨细胞内的转染和表达,可望成为软骨损伤基因治疗的新方法.     

The Research of EGFP Plasmid Transfection in Hepatoma Cells Mediated by Ultrasound Targeted Microbubble Destruction

目的 探讨超声靶向微泡破裂(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数.方法 体外培养HepG2细胞,在不同治疗超声的声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中的转染.荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测细胞的转染率,MTT法检测细胞活性.结果 在超声声强为2 w/cm2、占空比为20％、照射时间为60s时,HepG2细胞的7转染率最高,达到11.53％±2.15％,且细胞生存率大于85％.结论 UTMD是一种有效的基因转染方法,不同的超声转染参数对细胞活力和基因传输效率有较大影响,对其进行优化后可减少细胞损伤,增强基因转染.     

超声靶向微泡破裂介导EGFP质粒转染肝癌细胞的研究

目的探讨超声靶向微泡破裂(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数。方法体外培养HepG2细胞,在不同治疗超声的声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中的转染。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测细胞的转染率,MTT法检测细胞活性。结果在超声声强为2 w/cm2、占空比为20%、照射时间为60 s时,HepG2细胞的7转染率最高,达到11.53%±2.15%,且细胞生存率大于85%。结论 UTMD是一种有效的基因转染方法,不同的超声转染参数对细胞活力和基因传输效率有较大影响,对其进行优化后可减少细胞损伤,增强基因转染。     

RNAi对前列腺癌细胞水通道蛋白-1的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默AQP1基因对前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达影响。方法设计合成针对前列腺癌PC-3细胞AQP1基因的小干扰RNA并构建高效表达载体,脂质体法转染PC-3细胞,Western Blot检测AQP1蛋白表达的变化。结果 AQP1在前列腺癌PC-3细胞表达,针对AQP1基因siRNA高效表达载体能够抑制AQP1蛋白在PC-3细胞的表达,AQP1蛋白相对表达量为：转染组0.54±0.04,正常对照组0.82±0.08,差异有显著性（P〈0.01）。结论通过抑制AQP1基因的表达,有效抑制了前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达。     

20 kHz超声联合微泡诱导人前列腺癌PC3细胞的细胞自噬及早期凋亡

目的探讨低频、低功率超声联合微泡造影剂诱导人雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞早期细胞凋亡及自噬。方法以频率20kHz、声功率80mW超声连续波辐照人前列腺癌PC3细胞悬液60s,之后分为单纯微泡组(A)、单纯超声组(B)、超声联合微泡组(C)、空白对照组(D),分别给予相应处理。辐照后继续培养24h,以流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况,吖啶橙染色荧光显微镜观察细胞胞浆内酸性囊泡,透射电镜观察细胞自噬泡。结果 4组细胞早期凋亡率差异有统计学意义(P0.01);两两比较,除A组与D组差异无统计学意义(P0.05)外,余差异均有统计学意义(P0.01)。C组细胞核基本正常,胞浆内可见大量发红色荧光的酸性囊泡及大量由双层膜包裹的自噬泡或自噬体。D组细胞形态基本正常,胞浆内未见到明显自噬泡形成。结论低频低功率超声联合微泡造影剂能明显提高人雄激素非依赖型前列腺癌PC3细胞的早期凋亡率,并可促进细胞自噬。     

PED/PEA-15对前列腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨PED/PEA-15在前列腺癌细胞(PC-3)中的表达及意义。方法用RT-PCR法检测PC-3中PED/PEA-15的表达,并扩增出PED/PEA-15全长基因,以pEGFP-N1为载体构建其真核表达质粒。以脂质体法转染PED/PEA-15真核表达载体至PC-3中,用流式细胞和MTT法检测PED/PEA-15对PC-3凋亡和生长的影响。结果PED/PEA-15在PC-3中表达。酶切和DNA测序证实PED/PEA-15的真核表达载体构建成功。转染PED/PEA-15真核载体的PC-3细胞凋亡下调,且对肿瘤杀伤因子KillerTRAIL的敏感性亦下降。结论抗凋亡因子PED/PEA-15可阻抑PC-3的凋亡,PED/PEA-15的表达对前列腺癌的发展有重要作用。     

鱼精蛋白治疗前列腺癌鼠模型的超声造影表现

目的 :探索超声造影在鱼精蛋白治疗前列腺癌鼠模型研究中的应用价值。　方法 :将人PC 3m前列腺癌块移植于 2 4只Balb/c雄性裸鼠皮下。计算机辅助测定超声造影前后血流信号像素网格数 ,并与微血管密度(MVD)对照分析。　结果 :超声造影能提高肿瘤血流信号的显示 (P <0 .0 1) ,并与MVD有很好的相关性 (P <0 .0 5 )。　结论 :超声造影的血流信号测定值可以作为前列腺肿瘤的血流定量指标。     

异甘草素和Flutamide联合应用对人前列腺癌细胞体外增殖的抑制作用

目的观察异甘草素(ISL)和Flutamide联合应用对人前列腺癌细胞体外增殖的抑制作用。方法采用MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析Bcl-2表达。结果ISL和不同浓度Flutamide联合用药比单独应用Flutamide对前列腺癌PC-3细胞增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时显著下调Bcl-2基因表达,增加癌细胞凋亡。结论ISL和Flutamide联合应用对前列腺癌PC-3细胞增殖抑制作用明显增强,其机制可能与下调Bcl-2基因表达及增加癌细胞凋亡有关。     

Survivin启动子驱动腺病毒介导LRIG1基因治疗前列腺癌的体外实验

目的 由于去势抵抗性前列腺癌（CRPC）缺乏有效治疗方法,因此催生了探索新治疗模式的需求,其中靶向基因治疗可能是治疗CRPC的较理想模式;但是CRPC的靶向性基因治疗尚没有受到应有的关注.本课题拟研究Survivin启动子驱动的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl对前列腺癌细胞株的体外治疗效果.方法 用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人前列腺癌细胞PC-3M及人前列腺上皮细胞CRL-11609 RWPE-1,根据报告基因EGFR表达的不同计算病毒的细胞转染率.MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对PC-3M细胞生长的抑制作用.结果 当MOI=25时,Ad-Surp-LRIGl在PC-3M细胞中的转染效率为81.24%,在CRL-11609 RWPE-1细胞中转染率为0,在两种细胞内的转染率比较差异有显著性意义（χ2=65.18,P=0.000）;Ad-LRIGl在PC-3M细胞中的转染效率为77.22%,在CRL-11609 RWPE-1细胞中转染率为71.68%,转染率比较差异无显著性意义（χ2=0.051,P=0.802）.Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在PC-3M细胞中的转染率相比,差异无显著性意义（χ2=0.013,P=0.796）.在常规培养1d 后PBS组的细胞生长速度即开始超过Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞,4 d 后细胞生长速度差异显著（χ2=15.37,P=0.001）,而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论 Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人前列腺癌细胞PC-3M,能明显抑制体外前列腺癌细胞的生长.     

Exploration of target molecules for prostate cancer gene therapy

BACKGROUND: Focusing on Adv-FZ33, a modified adenovirus in which a synthetic 33-amino-acid immunoglobulin G-binding domain was inserted into the adenoviral fiber protein, we tried to identify suitable target molecules for prostate cancer-specific gene therapy. METHODS: Hybridomas were established from mice immunized with prostate cancer cell lines. The hybridomas were screened using Adv-FZ33 to create monoclonal antibodies (mAbs) that induced high gene transfer efficiency for PC-3 cells. Furthermore, we identified target antigens of the mAbs by immunoprecipitation and mass spectrometry, and investigated the expression of target molecules by flow cytometry and immunocytochemistry. RESULTS: Using Adv-FZ33, we established four different mouse mAbs that increased transduction efficiency for PC-3. The target antigens identified were Ep-CAM, CD155, HAI-1, and Na,K-ATPase beta1. These antigens were expressed in several cancer cell lines, including prostate cancer. Human prostatic myofibroblast cells lacked expression of Ep-CAM and HAI-1. CONCLUSIONS: We established anti-Ep-CAM mAb and anti- HAI-1 mAbs. Gene transduction via Ep-CAM and HAI-1 may be a novel strategy for treatment of prostate cancer.     

p27kip1高表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和侵袭转移的影响

目的　探讨外源性人p2 7kip1的高表达对前列腺癌PC 3细胞增殖和侵袭能力的影响。方法　利用携带人p2 7kip1基因的腺病毒 (Ad p2 7kip1)体外转染人前列腺癌PC 3细胞 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Western印迹法分别检测目的基因不同水平的表达 ,通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测PC 3转染前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞体外侵袭力的变化。以Ad X gal病毒作为对照。 结果　RT PCR、Western印迹法检测转染Ad p2 7kip1后PC 3细胞的p2 7kip1 mRNA(3 2 0bp)、p2 7蛋白 (2 7× 10 3 )表达阳性 ,转染后对PC 3细胞的生长有抑制作用 ,出现明显的G0 G1期阻滞 ,早期细胞凋亡率有所增加 ,与对照组比较差异有显著性 ,Boyden小室法检测转染后体外侵袭力受到明显抑制。结论　重组腺病毒介导的人 p2 7kip1基因在体外对前列腺癌细胞系PC 3的细胞增殖和侵袭力有明显抑制作用 ,可望作为前列腺癌基因治疗的有效工具。     

脂质体介导的单纯疱疹胸苷激酶基因在人前列腺癌细胞中的表达

目的：提取并鉴定已构建的EB病毒表达载体pDR2-TK，利用脂质体介导的基因转染技术将pDR2-TK转染人前列腺癌细胞并对单纯疱疹胸苷激酶（HSV－TK）表达状况进行检测。方法：采用DNA大量制备及纯化系统提取pDR2-TK，酶切和DNA测序进行鉴定，采用阳离子脂质体法将pDR2-TK导入激素非依赖性人前列腺癌细胞系PC－3m，逆转录PCR（RT－PCR）法和SABC免疫组化法检测TK mRNA和蛋白的表达。结果：扩增提取的质粒经PstⅠ和EcoR Ⅴ酶切后各获得4个及2个片段，与原基因酶切图谱一致；所提取质粒PCR产物经DNA测序，与NCBI公布的HSV－TK基因序列对照，证实所提取质粒含目的基因序,旨质体法转染PC－3m细胞后，mRNA和蛋白均有HSV－TK的表达，其蛋白表达率约为22％。结论：pDR2-TK质粒含有目的的基因HSV－TK，阳离子脂质体法可将pDR2-TK导入人前列腺癌细胞并获得较高效率的表达。