缺氧诱导因子-1α对低氧状态下前列腺癌PC-3细胞株增殖及侵袭的影响

目的 研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对低氧状态下前列腺癌PC-3细胞株增殖及侵袭的影响。 方法 利用转染试剂Fermentas将人HIF-1α重组表达质粒pcDNA3.1-HIF-1α转染PC-3细胞株后,低氧环境培养,采用G418筛选,建立稳定表达HIF-1α基因的细胞株,分别命名为pcD-NA3.1-HIF-1 α-PC-3、pcDNA3.1-PC-3及PC-3组。采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测3组细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达情况;噻唑盐法测定细胞生长;transwell小室检测侵袭能力。 结果 与pcDNA3.1-PC-3组和PC-3组相比,pcDNA3.1-HIF-1 α-PC-3组细胞内HIF-1α mRNA条带增强不明显,pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3组细胞内HIF-1α蛋白的条带明显增强,HIF-1α过表达的PC-3细胞增殖速度明显增快,侵袭细胞数明显增多。 结论 HIF-1α过表达对PC-3细胞株的增殖及侵袭具有促进作用。     

脯氨酸羟化酶2 siRNA对抗霉素诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 探讨是否脯氨酸羟化酶2 (PHD2) siRNA 通过减少缺氧诱导因子(HIF)1的降解而减轻缺氧引起的肾小管上皮细胞凋亡。方法 构建针对人PHD2的表达质粒,将其转染到培养的人肾小管上皮细胞系(HKC)中。用RT-PCR方法观察其对PHD2表达的抑制作用。Western印迹观察HIF-1α的表达。培养的HKC细胞分为对照组、模型组和siRNA组、siRNA组经PHD2 siRNA转染后与模型组同时用抗霉素诱导,用Western印迹方法观察3组细胞HIF-1α的表达,用流式细胞仪观察3组细胞的凋亡情况。 结果 经PHD2 siRNA转染的HKC细胞PHD2 mRNA表达明显下调(P < 0.01),HIF-1α蛋白表达明显上调(P < 0.05)。经抗霉素处理后,模型组和siRNA组HIF-1α蛋白表达均明显高于对照组(P < 0.01),但siRNA组HIF-1α蛋白表达高于模型组(P < 0.05。与模型组相比,siRNA组细胞凋亡明显减轻(P < 0.05)。 结论 通过RNA干扰技术抑制PHD2的表达可以增强HKC细胞HIF-1的蛋白表达,从而增强其在缺氧条件下的抗凋亡能力。     

MTA1基因调控人前列腺癌PC-3细胞失巢凋亡的研究

目的:探讨MTA1基因小干扰RNA(siRNA)对前列腺癌细胞PC-3增殖和失巢凋亡的影响。方法:应用MTA1 siRNA转染处理人前列腺癌细胞系PC-3后,采用实时定量PCR和W estern印迹检测MTA1基因mRNA和蛋白水平,采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,采用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测癌细胞失巢凋亡。结果:与对照组比较,MTA1基因siRNA转染组MTA1 mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性(r=0.935,P=0.0001)。MTA1 siRNA转染组软琼脂集落形成数明显减少,且与浓度相关(r=0.901,P=0.0005)。琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术结果显示,MTA1 siRNA转染可诱导前列腺癌细胞失巢凋亡,且与浓度相关(r=0.916,P=0.0003)。结论:MTA1 siRNA可抑制人前列腺癌细胞增殖,诱导失巢凋亡是其机制之一。     

siRNA沉默HIF-lα基因对前列腺癌PC3细胞生长增殖及凋亡的影响

目的探讨沉默缺氧诱导因子-lα(hypoxia inducible factor-lα,HIF-lα)基因对前列腺癌PC3细胞生长增殖及细胞凋亡的影响。方法实验分为PC3组(空白对照组)、PC3+NC si RNA组(阴性对照组)和PC3+HIFlαsi RNA组(干扰组)。使用经过筛选证实有效的HIF-lα-si RNA序列和阴性对照NC-si RNA序列,经脂质体Lipofectamine 2000转染PC3细胞。采用CCK-8法检测转染后96h内各组细胞的生长增殖情况,流式细胞仪检测转染后48h各组细胞的凋亡率。结果 PC3+HIF-lαsi RNA组肿瘤抑制率高于PC3+NC si RNA组,尤以转染后第48h表现得较为明显;在第48h,PC3+HIF-lαsi RNA组细胞存活率明显低于PC3组和PC3+NCsi RNA组(P0.01)。转染后第48h,干扰组细胞凋亡率为(11.2±1.13)%,PC3组和PC3+NC si RNA组细胞凋亡率分别为(2.4±0.26)%和(2.5±0.36)%,干扰组细胞凋亡率显著高于两对照组(P0.01)。结论沉默HIF-lα基因能抑制前列腺癌PC3细胞的生长,诱导癌细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA(siRNA)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响. 方法 根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体.以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率.实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组.转染后24、48和72 h,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率. 结果 与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48 h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52%.实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强.转染48 h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13.6%±1.8%. 结论 在RNAi研究中,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值.     

凋亡相关基因PDCD5对前列腺癌细胞PC-3M-1E8促凋亡作用的研究

目的:观察外源性PDCD5对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3M-1E8的促凋亡作用。方法:扩增重组质粒PCI-neo-PDCD5,利用脂质体介导将其瞬时转染前列腺癌细胞PC-3M-1E8,RT-PCR检测转染后表达情况;撤除血清培养16h后,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡指数,透射电子显微镜观察细胞形态。结果:MTT结果显示转染重组质粒组细胞较转染空载体和对照组细胞生长速度明显减慢,存活细胞明显减少(P<0.001);通过TUNEL与透射电镜观察,发现转染组细胞凋亡程度和数量明显增加,凋亡指数较对照组明显增高(P<0.001)。结论:PDCD5在撤出血清因素的诱导作用下能显著抑制前列腺癌细胞PC-3M-1E8在体外的生长,明显促进其凋亡。     

SLP-2对前列腺癌PC-3细胞增殖和早期凋亡的影响

目的探讨SLP-2（stomatin-like protein2）基因对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法合成和构建SLP-2沉默和过表达载体,用Lipofectamine TM2000分别转染5组人前列腺癌PC-3细胞：pcDNA3．1-SLP-2组,空质粒pcDNA3-1组,siRNA—SLP-2组,siRNA阴性对照组以及空白对照组。采用Q-PCR和Western-Blot分别检测PC-3细胞中SLP-2的mRNA和蛋白表达量;用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测PC-3细胞增殖;采用细胞线粒体膜电位JC-1试剂盒检测PC-3细胞的早期凋亡情况。结果转染pcDNA3．1-SLP-2质粒和siRNA-SLP-2后PC-3细胞SLP．2基因mRNA表达水平分别为（324．884±16．508）和（0．195±0．016）,蛋白表达水平分别为（5．013±0．284）和（0．296±0．011）,与空白对照组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）;转染pcDNA3-1-SLP-2基因48h、72h、96h后Pc。3细胞增殖吸光度值（OD值）分别为（0．714±0．007）、（1．103±0．018）、（1．348±0．018）,均显著高于空白对照组（P〈0．05）。采用siRNA沉默SLP．2基因48h、72h、96h后PC-3细胞增殖率分别为（0．571±0．004）、（0．875±0．010）、（1．044±0．008）,均显著低于空白对照组（P〈0．05）;细胞凋亡结果显示,转染pcDNA3．1-SLP．2和siRNA-SLP-2的PC-3细胞早期凋亡率分别为（2．433±0．577）和（9．197±0．602）,与空白对照组（4．993±0．710）相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论SLP-2可促进人前列腺癌PC-3细胞的增殖,并抑制细胞的早期凋亡。     

凋亡相关基因PDCD5对前列腺癌细胞PC-3M-1E8促凋亡作用的研究

目的：观察外源性PDCD5对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3M-1E8的促凋亡作用。方法：扩增重组质粒PCI-neo-PDCD5,利用脂质体介导将其瞬时转染前列腺癌细胞PC-3M-1E8,RT-PCR检测转染后表达情况;撤除血清培养16h后,通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞存活率,原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡指数,透射电子显微镜观察细胞形态。结果：MTT结果显示转染重组质粒组细胞较转染空载体和对照组细胞生长速度明显减慢,存活细胞明显减少（P〈0.001）;通过TUNEL与透射电镜观察,发现转染组细胞凋亡程度和数量明显增加,凋亡指数较对照组明显增高（P〈0.001）。结论：PDCD5在撤出血清因素的诱导作用下能显著抑制前列腺癌细胞PC-3M-1E8在体外的生长,明显促进其凋亡。     

VP3基因联合多西紫杉醇诱导人前列腺癌细胞株凋亡的实验研究

目的 观察VP3基因、多西紫杉醇各浓度及VP3基因联合多西紫杉醇各浓度对PC-3细胞株的凋亡作用.方法 构建重组真核表达载体PcDNA3-VP3,采用基因转染法转染人前列腺癌细胞株PC-3.利用RT-PCR技术检测VP3基因在PC-3细胞株中的表达状况.将多两紫杉醇浓度分为3组,分别为10-8 mol/L、10-7mol/L、 10-6mol/L.应用光镜、HE染色、透射电镜形态学、MTT法、流式细胞仪TUNEL法观察转染重组质粒PcDNA3-VP3单独或联合多西紫杉醇各浓度对前列腺癌细胞株PC-3的影响.结果 VP3基因转染PC-3细胞后在细胞中得到了表达.HE染色和透射电镜下观察到PC-3细胞的典型凋亡形态学特征.MTT法检测结果显示转染质粒PcDNA3-VP3,单独应用10-7mol/L以上浓度的多西紫杉醇及转染质粒PcDNA3-VP3联合应用10-8mol/L以上浓度的多西紫杉醇均可使PC-3细胞株的增殖活性明显下降(P＜0.01).流式细胞仪TUNAL法检测单独转染质粒PcDNA3-VP3、质粒PcDNA3-VP3联合10-8mol/L浓度组及质粒PcDNA3-VP3联合10-77mol/L浓度组后24h、48h、72h各个时间点上的PC-3细胞株凋亡率分别为(20.31±1.96)%、(41.50±1.03)%、(50.03±3.00)%,(P＜0.01):(31.10±0.59)%、(53.10±0.77)%、(68.90±2.66)%(P＜0.01);(40.01±0.53)%、(62.23±0.74)%、(75.20±0.53)%(P＜0.01).结论 联合10-8mol/L以上浓度的多西紫杉醇能明显增加VP3基因诱导人前列腺癌PC-3细胞株凋亡.     

低氧诱导因子-3α对胎盘滋养层细胞生长的影响

目的研究低氧诱导因子-3α(HIF-3α)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo)生物学行为的影响。方法构建人HIF-3α过表达载体(pcDNA3.1-HIF-3α),并筛选HIF-3α抑制剂(HIF-3αsiRNA)最佳靶序列;用2.5μg的pcDNA3.1-HIF-3α质粒和75 pmol/L的HIF-3αsiRNA分别转染HTR8/SVneo细胞作为转染组,同时各自设立阴性转染组。采用EdU法和MTT法检测细胞增殖和细胞活力水平;用细胞流式法检测细胞凋亡水平;并用细胞培养小室(Transwell)法检测细胞浸润和迁移的能力。结果蛋白质印迹法(Western Blot)结果表明成功构建了过表达载体pcDNA3.1-HIF-3α,并筛选到HIF-3αsiRNA#2是最佳抑制靶序列(P<0.05)。EdU实验结果显示,过表达HIF-3α使细胞的增殖显著增强(P<0.05),敲低HIF-3α则使细胞的增殖显著下降(P<0.05)。MTT法检测发现,过表达HIF-3α后细胞活力无显著差异(P>0.05);敲低HIF-3α后细胞活力显著升高(P<0.05)。细胞流式法检测发现,HIF-3α过表达有降低HTR8/SVneo细胞早期凋亡的趋势,但无显著差异(P>0.05);HIF-3α敲低后细胞凋亡无显著差异(P>0.05)。Transwell小室法检测发现,HIF-3α过表达使细胞的迁移以及浸润显著增强(P<0.05),而HIF-3α敲低后细胞的迁移以及浸润显著下降(P<0.05)。结论HIF-3α是调节HTR8/SVneo细胞增殖、迁移和浸润能力的重要因子。     

不同方法转染人前列腺癌PC-3细胞pEGFP-N1基因的体外实验研究

目的:探讨转染人前列腺癌PC-3细胞pEGFP-N1基因的最佳转染方法。方法:以超声微泡造影剂、超声辐照、脂质体转染及其相互结合的方法,将质粒pEGFP-N1基因转染人前列腺癌PC-3细胞,24h后以荧光显微镜观察前列腺癌PC-3细胞中的绿色荧光蛋白表达情况,并用流式细胞仪测定转染率。结果:以超声+微泡+脂质体组基因转染效率最高,与其他组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:超声联合微泡与脂质体结合能明显提高pEGFP-N1基因在人前列腺癌细胞中的转染率,是一种较理想的基因转染方法。     

靶向TRPV6的siRNA对前列腺癌LNCaP细胞抑制作用的体外研究

目的:运用RNA干扰(RNAi)技术阻断前列腺癌LNCaP细胞中瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚家族6(TRPV6)基因的表达,探讨TRPV6基因沉默对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:针对TR-PV6基因,构建2条小干扰RNA(siRNA)序列;在脂质体介导下转染前列腺癌LNCaP细胞,用RT-PCR测定TRPV6mRNA的表达;MTT法和流式细胞技术测定siRNA对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果:两条siRNA序列均能有效地阻断LNCaP细胞中TRPV6基因在mRNA水平上的表达(P<0.01),且mRNA表达随着转染时间的延长而减少,转染72h后TRPV6mRNA的表达减少至对照组的27%和23%;siRNA转染能显著抑制LNCaP细胞增殖,转染48h细胞增殖抑制率最高,分别为34.53%和29.32%,与转染24h和72h比较有统计学意义(P<0.05);转染48h后,siRNA转染组G0～G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少,与空白对照组及阴性对照组相比有统计学差异(P<0.01);siRNA转染组细胞的凋亡率分别为14.45%和12.73%,显著高于空白对照组及阴性对照组3.78%和5.22%(P<0.05)。结论:针对TRPV6的siRNA在体外能有效地抑制LNCaP细胞TRPV6mRNA的转录,同时能够抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,使细胞周期出现G0/G1期阻滞,细胞凋亡率显著增加。     

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人大肠癌细胞LOVO／5-Fu多药耐药的研究

目的：探讨短发夹RNA（shRNA）沉默多药耐药MDR）基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白（P-gp）的表达,Realtime-PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化。结果：与对照组质粒组和未转染组相比,转染含shRNA干扰质粒细胞的实验组IC50明显降低,为（2.304±0.232）μmol/L,且差异有统计学意义（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为73.8%;凋亡率明显升高为（5.767±0.694）%（P〈0.05）;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）。结论：靶向MDR1的shRNA干扰质粒有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,有可能为临床上克服大肠癌化疗过程中出现的耐药提供新的作用靶点和治疗途径。     

shRNA沉默GnT-Ⅴ基因表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-Ⅴ)的小片段发夹状RNA(shRNA)表达质粒,研究shRNA表达质粒沉默GnT-Ⅴ基因后对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对GnT-Ⅴ基因的小干扰RNA(siRNA)靶序列,构建shRNA表达载体并转染PC-3细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GnT-Ⅴ基因的细胞株,采用RT-PCR和蛋白质印迹检测GnT-ⅤmRNA和蛋白的表达,并通过CCK-8增殖实验、流式细胞仪评价GnT-ⅤshRNA对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建了GnT-ⅤshRNA表达质粒,且该质粒明显下调GnT-Ⅴ的表达;PC-3细胞GnT-Ⅴ/1079的mRNA和蛋白质水平的抑制率分别为76.5%和67.0%,对PC-3细胞呈明显抑制效应;CCK-8增殖实验显示,与对照组相比,PC-3GnT-Ⅴ/1079的增殖受到明显抑制(P<0.01),以48h为著;流式细胞仪检测结果表明,PC-3GnT-Ⅴ/1079的凋亡率明显增加(P<0.05)。结论 shRNA GnT-Ⅴ能显著降低GnT-Ⅴ基因的表达水平,从而有效抑制PC-3细胞增殖,并促进细胞凋亡,该GnT-Ⅴ的siRNA序列可能成为治疗前列腺癌的有效靶点。     

沙利度胺对前列腺癌PC3细胞的体外作用及机制研究

目的 研究沙利度胺对激素非依赖性前列腺癌(AIPC)细胞株PC-3体外生长的抑制作用及其可能的机制.方法 将不同浓度的沙利度胺作用于AIPC细胞株PC-3,采用CCK-8法检测沙利度胺对PC-3细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测凋亡率;通过RT-PCR法检测沙利度胺处理前后PC-3细胞中低氧诱导因子-1(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达水平;Western blot检测沙利度胺作用后HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平.结果 不同浓度的沙利度胺作用于PC-3细胞后,细胞增殖水平明显下降(P＜0.05),且沙利度胺对PC-3细胞增殖的抑制作用呈浓度-时间依赖性.流式细胞仪检测结果表明不同浓度的沙利度胺诱导PC-3细胞发生凋亡,和对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).随着沙利度胺浓度的增加,PC-3细胞中HIF-1 α、VEGF mRNA的表达逐渐下调;HIF-1α、VEGF和Bcl-2蛋白的含量逐渐下降,而Bax蛋白的含量逐渐增加.结论 沙利度胺可能通过诱导AIPC细胞的凋亡和抑制肿瘤血管的生成而发挥双重抗肿瘤生长的作用.     

短发夹状RNA抑制缺氧诱导因子1α在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状RNA(shRNA)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shRNA表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shRNA在PC-3M细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),转染后48 h HIF-1αmRNA和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P<0.01);而阴性对照组HIF-1α表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shRNA表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。     

基质交联分子1对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的:观察抑制基质交联分子1(STIM1)对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将携带STIM1基因的小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体STIM1-pGCSIL-GFP转染人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,3d后荧光倒置显微镜观察转染效率;1周后RT-PCR及Western印迹验证STIM1抑制表达有效性,并采用Western印迹检测PC-3细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,survivin、激活型Caspase-3的表达水平。结果:倒置显微镜观察发现PC-3细胞病毒转染效率80%。转染1周后,RT-PCR及Western印迹显示STIM1被有效抑制。抑制STIM1表达后,对照组Bcl-2/Bax比率为1.24,干扰组PC-3细胞Bcl-2/Bax比率为0.31,比率显著下降;干扰组PC-3细胞survivin表达明显降低,相对表达量为对照组的0.14倍;Caspase-3裂解激活相对表达量为对照组的1.52倍(P0.05)。结论:STIM1在前列腺癌PC-3细胞中可视为致癌基因,抑制其表达可通过下调Bcl-2/Bax比率,降低survivin表达,激活Caspase-3级联通路,诱导细胞凋亡。     

小分子RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α加重缺氧状态肾小管上皮细胞的生长抑制和坏死

目的 探讨沉默缺氧诱导因子1α （HIF-1α）对缺氧状态肾小管上皮细胞增殖、凋亡和坏死的影响。 方法 利用氯化钴模拟缺氧状态,并应用小分子RNA干扰（siRNA）技术沉默HIF-1α基因表达。将细胞分成5组,分别是正常培养组、缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组。用MTT试验检测细胞的生长抑制率;用TUNEL法、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（aspase）-3蛋白定量法检测细胞的凋亡率;检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活力来测定细胞的坏死情况;用实时定量PCR法和Western印迹法检测细胞HIF-1α、HIF-2α、葡萄糖转运蛋白1（Glut-1）、血管内皮生长因子（VEGF） mRNA和蛋白表达水平。 结果 （1）siRNA的细胞转染效率为95%～100%。在常氧条件下,终浓度100 nmol/L 的HIF-1α siRNA沉默HIF-1α基因的效率为70%;在缺氧条件下,HIF-1α siRNA沉默HIF-1α基因的效率达到97%。（2）HIF-1α siRNA组细胞的生长抑制率显著高于其它组（P < 0.05）;细胞凋亡率在缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组4组间的差异无统计学意义（P > 0.05）;HIF-1α siRNA组细胞培养液中LDH水平显著高于缺氧培养组、转染试剂组和阴性对照组（P < 0.05）。（3）HIF-1α siRNA组细胞的HIF-1α、Glut-1、VEGF mRNA和蛋白表达量显著低于缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组（P < 0.05）;而HIF-2α mRNA和蛋白表达在缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组4组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 siRNA沉默HIF-1α能显著抑制缺氧状态下肾小管上皮细胞Glut-1和VEGF表达,加重缺氧状态下肾小管上皮细胞的生长抑制和坏死。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对Omi/HtrA2不同表达水平前列腺癌细胞的促凋亡作用

目的 观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对前列腺癌细胞(PC-3M)不同丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2表达水平的促凋亡作用.方法 构建其小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,辅助设计Omi/HtrA2特异性siRNA序列.合成后克隆入真核表达载体psiRNA-hH1neo.脂质体法转染psiRNA-Omi/HtrA2载体至PC-3M中,检测Omi/HtrA2在PC-3M细胞中的表达及psiRNA-Omi/HtrA2对Omi/HtrA2沉默效应后的转录和表达.用原位末端转移酶标记技术检测Omi/HtrA2基因沉默后,计算不同浓度TRAIL(50、100、200、500 μg/L)下PC-3M细胞凋亡指数(AI).结果 Omi/HtrA2在PC-3M细胞中高表达.酶切和DNA测序证实siRNA基因序列正确,且准确克隆入psiR-NA-hH1neo载体中.psiRNA-Omi/HtrA2载体可特异性抑制PC-3M细胞中Omi/HtrA2的表达.不同浓度TRAIL(50、100、200、500 μg/L)对转染psiRNA-Omi/HtrA2载体后PC-3M细胞AI分别为7.23、14.87、22.65、31.78.而未转染组分别为15.28、24.17、36.33、47.76.两组之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 Omi/HtrA2在前列腺癌细胞凋亡过程中起重要作用,TRAIL促进前列腺癌细胞的凋亡,其效果与TRAIL浓度及Omi/HtrA2表达水平相关.     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对人膀胱尿路上皮癌T24细胞增殖和凋亡的影响

目的 探究RNA干扰靶向沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在人膀胱尿路上皮癌(BUC) T24细胞株中的表达对T24细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建4个针对HIF-1α的小干扰RNA(siRNA)表达质粒PGC-siHIF-1α1-4,脂质体法稳定转染T24细胞.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染细胞HIF-1α rnRNA和基因表达,噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖率,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期和凋亡情况.结果 4个HIF-1α mRNA表达质粒均能不同程度的抑制转染细胞的HIF-1α膜mRNA和基因表达.其中以PGC-siHIF-1 α3的作用最大,效果最佳,该组G0/G1期阻滞率(61.8±1.5)％,细胞增殖受抑率41.7％,细胞凋亡率19.3％,与对照组有统计学差异(P＜0.01).结论 HIF-1α siRNA表达质粒可抑制膀胱癌细胞生长并促进其凋亡,有望成为提高膀胱癌分子靶向治疗的新位点.