质粒平均分配基因parDE对甲酸脱氢酶NADH再生系统稳定性的影响

将质粒平均分配基因parDE引入重组质粒pDK7-fdh(携带甲酸脱氢酶基因fdh)中,得到基因重组菌F6.考察了F6与未引入parDE基因的基因重组菌FY(含重组质粒pDK6-fdh)和F-1(含重组质粒pMAL-p2X-fdh)的质粒遗传稳定性及甲酸脱氢酶活性的差异.结果显示,F6传代160代后,仅有3%的菌质粒丢失,而基因重组菌F-1和FY(均只携带fdh基因)传代160代后,丢失质粒的菌分别占93%和78%.传代160代后,F6的甲酸脱氢酶比酶活为2.77 U/mg,比传代前降低1.77%,FY为2.02 U/mg,F-1与野生型菌株M5al相近,为1.33 U/mg.结果表明,引入parDE基因的基因重组菌质粒稳定性和甲酸脱氢酶活性均远高于未引入parDE基因的基因重组菌.     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定

目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。     

基因敲除弱化产1,3-丙二醇Klebsiella pneumoniae荚膜多糖的合成

1,3-丙二醇(1,3-PDO)是重要的平台化合物,在高性能纤维合成等领域具有广泛应用。Klebsiella pneumoniae是优良的1,3-PDO生物合成细胞工厂,但该菌代谢甘油合成1,3-PDO时积累大量荚膜多糖,影响底物与产物的高效转运,导致发酵液黏度增大,限制发酵法生产1,3-丙二醇的下游提取及产业化。本研究基于已报道的K.pneumoniae荚膜合成途径,利用Red重组技术对K.pneumoniae荚膜多糖合成途径中的起始糖基转移酶wec A基因及参与荚膜多糖后期组装的跨膜蛋白wzi基因进行敲除,并考察上述基因缺失对菌株荚膜含量、细胞形态、菌体生长、发酵液黏度及产物合成的影响。研究发现,同时缺失wec A和wzi基因对于弱化荚膜多糖效果显著,荚膜含量降低38.5%,细胞基本丧失菌毛合成及相互粘连能力,1,3-PDO产量提高23.0%,为菌株改造提供了一种新思路。     

乙肝病毒前S1基因与截短C基因穿梭表达载体构建

目的构建HBV前S1基因和截短C基因分泌型大肠杆菌和分枝杆菌穿梭质粒。方法以含HBV基因组质粒pCP10序列为模板,PCR扩增前S1基因和C基因截短片段,依次克隆至分泌型穿梭表达载体pDE22,电穿孔转化法将重组质粒导入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选及PCR鉴定,阳性克隆热休克诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析。结果扩增到了预期长度的2个目的基因,构建了分泌型穿梭载体,SDS-PAGE分析可见相对分子质量约23000蛋白表达条带。结论已成功构建耻垢分枝杆菌分泌表达前S1基因和截短C基因的穿梭载体,为研究含前S基因和截短C基因的重组BCG疫苗奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌脂肪酶表达质粒的构建及其表达

以枯草芽孢杆菌168(B.subtilis 168)染色体为模板PCR扩增出P43启动子,与大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pUBC19相连得到表达载体pUBC-P43,然后将枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipA克隆到载体pUBC-P43启动子下游,得到重组质粒pUBCPL并转化B.subtilis TZ10.经中性红油脂平板、酶切和PCR方法鉴定得到重组菌TZ10/pUBCPL.宿主菌TZ10是B.subtilis DB104染色体缺失了lipA基因后获得.重组菌经初步发酵,以橄榄油为底物测定发酵上清液最高脂肪酶活力为49.1 U·L-1,而相应菌株DB104发酵最高酶活力仅为11.4 U·L-1.     

Pre-miR-10a重组腺病毒质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建pre-miR-10a(miR-10a前体)重组腺病毒表达质粒,感染K562细胞,并检测其基因表达水平。方法化学合成pre-miR-10a基因序列,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,将构建正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV pre-miR-10a与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183感受态细胞,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,经4轮扩增后检测病毒滴度。收集病毒后,以100 MOI感染K562细胞,RT-PCR法检测miR-10a基因的转录水平。结果重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a经PacⅠ酶切,证明带有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中,4轮扩增后腺病毒滴度为1.5×1011pfu/ml,可高效感染K562细胞,感染效率达90%以上;重组腺病毒Ad-pre-miR-10a感染的K562细胞中miR-10a基因转录水平明显升高,过表达率为150.82%。结论已成功构建重组腺病毒表达质粒pAd-pre-miR-10a,并可在K562细胞中高效表达,为进一步从体内和体外水平研究其抗白血病效应奠定了基础。     

磷酸酶张力蛋白同系物基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建携带磷酸酶张力蛋白同系物(phosphoatase and tensin homolog,PTEN)基因的sh RNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。方法在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的psh RNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的psh RNA,将其克隆至重组穿梭载体p Shuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒p Shuttle-GFP-PTEN-sh RNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体p Adxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA。将重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA,经3轮扩增,测定病毒滴度。荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。结果与空白对照组比较,psh RNA1和psh RNA3组中PTEN基因m RNA表达量分别下降了44%和68%(P<0.05,确定p GPU6/GFP/Neo-PTEN-sh RNA3为最佳转染质粒);重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42%和51%(P<0.05)。结论成功构建了PTEN基因sh RNA重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2(ATP-dependent Clp regulatory subunit C2,ClpC2)基因的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ClpC2基因,插入表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-ClpC2,经双酶切及测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-ClpC2,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpC2蛋白的生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白。方法利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100%;SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43000,表达量占菌体总蛋白的20%以上;Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合。结论已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料。     

用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株的构建

目的利用λ噬菌体Red重组酶系统,构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用PCR方法,将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因拼接,使其两端带有与四环素基因同源的36nt序列;利用λ噬菌体Red重组酶系统,将其整合到大肠杆菌XL1-Blue的附加体上,以替换掉四环素基因,经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,获得包装菌株XLe-pⅢ;将基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组导入包装菌株,制备缺陷型辅助噬菌体,集落形成试验检测缺陷噬菌体的感染能力。结果所构建的包装菌株XLe-pⅢ经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,证明氯霉素抗性基因已与噬菌体基因Ⅲ一同整合到附加体上,重组菌不能在含有氨苄西林的LB培养基中生长,仍保留四环素抗性;该包装菌株能用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,制备的缺陷型辅助噬菌体的滴度为3.0×108。结论利用λ噬菌体Red重组酶系统,已成功构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株,以其制备的缺陷型辅助噬菌体有望用于常规筛选或SIP体系。     

Direct Cloning, Genetic Engineering, and Heterologous Expression of the Syringolin Biosynthetic Gene Cluster in E. coli through Red/ET Recombineering

The reconstruction of a natural product biosynthetic pathway from bacteria in a vector and subsequent heterologous expression in a technically amenable microbial system represents an efficient alternative to empirical traditional methods for functional discovery, yield improvement, and genetic engineering to produce "unnatural" derivatives. However, the traditional cloning procedure based on genomic library construction and screening are complicated due to the large size (>10 kb) of most biosynthetic pathways. Here, we describe the direct cloning of a partial syringolin biosynthetic gene cluster (sylCDE, 19 kb) from a digested genomic DNA mixture of Pseudomonas syringae into a plasmid in which sylCDE is under the control of an inducible promoter by one step linear-plus-linear homologous recombination (LLHR) in Escherichia coli. After expression in E. coli GB05-MtaA, two new syringolin derivatives were discovered. The complete syringolin gene cluster was assembled by addition of sylAB and exchange of a synthetic bidirectional promoter against the native promoter to drive sylB and sylC expression by using Red/ET recombineering. The varying production distribution of syringolin derivatives showed the different efficiencies of native and synthetic promoters in E. coli. The successful reconstitution and expression of the syringolin biosynthetic pathway shows that Red/ET recombineering is an efficient tool to clone and engineer secondary metabolite biosynthetic pathways.     

醛脱氢酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇的影响

利用Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇时，一部分甘油通过氧化代谢途径大量合成副产物乙醇，降低了1,3-丙二醇的得率.醛脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为NAD⁺，降低了同为NADH依赖型的1,3-PD合成途径的效率.本文以醛脱氢酶ALDH为改造目标，以K.pneumoniae为宿主，通过同源重组技术在K.pneumoniae M5aL的ALDH基因中成功地插入了四环素抗性基因，经抗性筛选和基因水平鉴定，得到两株ALDH基因敲除的重组菌0623-1hb及0623-1hc.本文研究了这两株重组菌的生长代谢特性，结果表明两株重组菌的ALDH酶活基本检测不到，菌体生长受到明显抑制，乙醇合成浓度比出发菌株K.pneumoniae M5aL降低了43%～53%，1,3-PD合成浓度及摩尔得率分别提高了27%～42%和19%～24%.     

Rcs信号系统对克雷伯氏肺炎杆菌荚膜合成的影响

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要工业微生物,菌细胞表面具有荚膜结构,荚膜对于菌株的生理特性和工业应用具有重要的影响。Rcs磷酸化信号系统是一种对菌株荚膜合成具有调控作用的信号系统。利用Red同源重组技术,分别构建了基因rcsA, rcsB缺失的菌株,还构建了基因rcsA, rcsB单独过表达的菌株。这些菌株的生理特性的研究结果表明,rcsA及rcsB基因的缺失会显著降低荚膜合成水平,进而提高外源DNA的转化细胞的效率。rcsA及rcsB缺失菌株分别在以葡萄糖和甘油为碳源的培养基中培养时,菌体更易从发酵液中进行分离,主要代谢产物2,3-丁二醇和1,3-丙二醇的产量均有少量提高。rcsA和rcsB基因的过表达均抑制菌株生长,降低外源DNA的转化细胞的效率。相对于野生菌,过表达的菌胞外多糖的含量提高,发酵液的黏度增加,rcsA过表达菌株胞外多糖的含量达到了10.33 g/L,是野生菌的5倍。通过调控rcsA及rcsB基因的活性可调控菌株荚膜多糖的合成,进而影响菌株细胞沉降、代谢物合成、胞外多糖含量等多方面的生理特性。     

连续3次基因抓捕构建人EEF1A1-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的利用人类真核翻译延伸因子1A1(Human eukaryotic translation elongation factor 1A1,hEEF1A1)基因座完整的上下游调控序列和人凝血因子Ⅶ(Human coagulation factorⅦ,hFⅦ)基因组序列构建hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。方法首先构建连入6个同源臂的pBR322作为连续3次基因抓捕的载体;然后通过Red同源重组系统,在大肠杆菌内进行缺口修复。第一步将hEEF1A1基因3′端侧翼序列亚克隆至抓捕载体上,第二步将hFⅦ完整基因组序列亚克隆至抓捕载体上,第三步将hEEF1A1基因5′端完整侧翼序列亚克隆至抓捕载体上。结果经3次基因抓捕,3个基因片段在抓捕载体上无痕连接,形成一条长约50 000 bp的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。经PCR、酶切及测序验证,构建的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座中,原hEEF1A1基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ基因组序列精确置换。结论成功构建了hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座,为哺乳动物细胞表达大载体的制备提供了实验依据。     

重组甲酸脱氢酶对合成1,3-丙二醇的促进作用

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中，需要消耗还原当量NADH，NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量。本文从Candida boidinii基因组DNA中克隆了甲酸脱氢酶基因fdh，利用表达质粒pMAL TM-p2X-fdh转化到1,3-丙二醇生产菌 Klebsiella pneumoniae YMU2中，构建了具有NADH再生系统的重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。在5 L发酵罐培养中，F-1合成1,3-丙二醇浓度和产率分别达到了78. 6 g·L-1 和1. 33 g·L-1·h-1，分别比YMU2提高了12. 5% 和41. 2%。根据F-1和YMU2菌株的主要代谢产物的生成情况比较了二者的代谢流分布。     

基因敲除技术研究进展

基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法,是后基因组时代的重要研究内容.从基因敲除的细胞基础、基因敲除载体的构建及发生同源重组干细胞的筛选、基因敲除动物模型的建立、基因敲除与基因拯救、国内基因敲除技术的研究现状等方面概括了基因敲除技术的研究进展和该技术目前存在的主要问题.     

酸处理改善1,3-丙二醇发酵液过滤效果的研究

克雷伯氏肺炎杆菌TUAC01产1,3-丙二醇生发酵液不能通过絮凝或过滤的方法得到澄清。研究采取酸处理的方法进行澄清,结果表明,酸处理后发酵液可经过滤进行澄清,同时发酵液还能自然沉降澄清。酸处理最适操作条件为:温度80—100℃、pH值为3.0、时间30—60 min。发酵液酸处理后滤纸过滤清液OD650降为0.01,降低了99.9%,黏度下降明显,其粘滞系数降为0.001 5 Pa.s;蛋白质质量浓度降低至0.05 mg/mL,降低了98%—99%。该酸处理方法经车间大规模实践,效果理想,可作为带荚膜菌种发酵所得发酵液的澄清处理方法。     

Klebsiella pneumoniae yggG Gene Product: A Zinc-Dependent Metalloprotease

Klebsiella pneumoniae causes neonatal sepsis and nosocomial infections. One of the strains, K. pneumoniae MGH 78578, shows high level of resistance to multiple microbial agents. In this study, domain family, amino acid sequence and topology analyses were performed on one of its hypothetical protein, YggG (KPN_03358). Structural bioinformatics approaches were used to predict the structure and functionality of YggG protein. The open reading frame (ORF) of yggG, which was a putative metalloprotease gene, was also cloned, expressed and characterized. The ORF was PCR amplified from K. pneumoniae MGH 78578 genomic DNA and cloned into a pET14-b vector for heterologous expression in Escherichia coli. The purified YggG protein was subsequently assayed for casein hydrolysis under different conditions. This protein was classified as peptidase M48 family and subclan gluzincin. It was predicted to contain one transmembrane domain by TMpred. Optimal protein expression was achieved by induction with 0.6 mM isopropyl thiogalactoside (IPTG) at 25 °C for six hours. YggG was purified as soluble protein and confirmed to be proteolytically active under the presence of 1.25 mM zinc acetate and showed optimum activity at 37 °C and pH 7.4. We confirmed for the first time that the yggG gene product is a zinc-dependent metalloprotease.     

人乳头状瘤病毒16亚型E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突状细胞中的表达

目的 构建人乳头状瘤病毒16亚型(Human papillomavirus 16,HPV16)E6E7基因重组腺病毒,并在小鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic cell,DC)中表达。方法双酶切质粒pET-32a(+)-E6E7获得E6E7,基因片段,插入腺病毒穿梭质粒pAd-Track-CMV中,转染HEK293细胞,扩增病毒,经同源重组、包装后获得重组腺病毒pAd-E6E7,转染体外培养的小鼠骨髓源DC,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠DC的形态,流式细胞术检测转染前后小鼠DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C),Western blot检测E6蛋白的表达。结果双酶切及测序证实,重组腺病毒质粒pAd-E6E7构建正确,插入的E6E7基因片段序列正确;转染HEK293细胞48 h,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,重组腺病毒的滴度为3×107 CCID50/ml;重组腺病毒pAd-E6E7感染后DC的状态与成熟DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)相符合,感染后的DC表面有许多树枝状、刺状突起,符合成熟DC的表面形态;感染后的DC中存在E6蛋白的表达。结论已成功构建了HPV16 E6E7基因重组腺病毒表达质粒,其能在小鼠骨髓源DC中表达。