2株广西鸭源H6N2亚型禽流感病毒遗传进化以及对BALB/c小鼠的致病性分析

目的：探讨广西鸭源H6N2亚型禽流感病毒的分子遗传特征，评估其对哺乳动物BALB/c小鼠的致病性。方法：选择前期在广西分离的2株鸭源性H6N2禽流感病毒A/DK/GX/3101/2018(GX3101)、A/DK/GX/5220/2018(GX5220)，基因测序和遗传进化分析病毒全基因组的核苷酸同源性及遗传进化，受体结合特异性法分析2株病毒的受体结合特性，应用BALB/c小鼠评估鸭源H6N2病毒的致病性。结果：2株H6N2病毒属于欧亚谱系，HA裂解位点处为PQIETG/GL，属低致病性禽流感病毒特征，HA蛋白氨基酸位点出现E190V位点的氨基酸突变，2株病毒均识别与结合禽型SAα-2,3 Gal受体。病毒接种小鼠后，肺组织病毒分离培养阳性，小鼠肺组织出现炎症细胞浸润、肺泡结构完整性破坏，免疫组化检测病毒抗原显示，GX3101病毒接种小鼠的肺组织出现流感病毒核蛋白（NP）阳性。结论：广西鸭源H6N2毒株具有禽流感病毒的特点，可不经适应直接跨种属间屏障感染哺乳动物小鼠，须密切监测家禽中流感病毒H6N2流行和进化演变。     

A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响研究

目的研究A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响。方法选择A/Californ ia/04/2009,A/S ichuan/1/2009和A/Be ijing/3/2009 3株病毒,分别感染MDCK细胞,测定病毒RNA载量和病毒效价;同时滴鼻接种BALB/c小鼠,检测小鼠感染后的多项指标,观察期为14天。另一方面,对3株病毒的全基因组进行测序及序列比对,对其基因突变情况及多态性进行分析。结果 A/S ichuan/1/2009株相较而言具有较高的复制能力及毒力,序列分析结果显示全基因中有5个氨基酸发生了突变,其中PA蛋白中343位点的A突变为T,PB1蛋白中353位点的K突变为R,566位点的T突变为A,PB2蛋白中471位点的T突变为M,对病毒毒力的增强起重要作用。结论 A(H1N1)甲型流感病毒基因组多态性与其复制及毒力密切相关。     

两株人H7N9禽流感病毒的全基因组测序及分子特征分析

【目的】对两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的人H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,研究其来源、基因组特征以及相互间的分子差异,旨在了解毒株的遗传进化特征与其致病性及其所致疾病临床类型的关系,为进一步阐明H7N9禽流感病毒的致病机制提供科学依据。【方法】选取两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的H7N9禽流感病毒进行全基因组序列测定;运用生物信息学软件比较分析两株病毒的遗传进化关系、基因组特征、受体结合位点、宿主特异性位点及致病相关位点等重要分子特征;从禽流感共享数据(GISAID)下载2013年至2014年10月轻症和重症病例的病毒分离株序列,分析致病相关关键位点差异,并分析这些变异与其致病性及所致疾病临床类型的关系。【结果】这两株H7N9禽流感病毒的HA、NA和M基因来源于2013年华东地区流行的H7N9禽流感病毒,NP、NS、PA、PB1和PB2基因来源于2013年在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒;H7N9禽流感病毒PA蛋白L336M和PB1蛋白I368V的突变率随流行时间的延长而逐渐上升,并存在地区差异;两株病毒各基因核苷酸同源性达到99.2%以上,氨基酸同源性在99.5%以上,但各基因节段存在个别氨基酸的差异,其中HA受体结合位点存在一个关键氨基酸的差异(226L和226 Q),宿主特异性位点存在两个关键氨基酸的差异(PB2-591L和PB2-591Q,PB2-627E和PB2-627K),毒力位点存在两个关键氨基酸差异(PA-353R和PA-353K,PB2-627E和PB2-627K);M2均发生了S31N突变;潜在糖基化位点均相对保守;2013年至2014年10月报道的重症病例病毒分离株PB2蛋白E627K突变率高于轻症病例分离株。【结论】两株来自不同临床类型的H7N9禽流感病毒是一种新的重组病毒,是由华东地区流行的人H7N9禽流感病毒和在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒基因重组而来;H7N9禽流感病毒的某些致病相关的关键氨基酸位点在流行的过程中不断发生变异,必须密切监测毒株的变异动向;两株致病力不同的病毒各基因节段虽然同源性较高,但存在关键氨基酸位点的差异,其中PB2蛋白627位氨基酸位点的差异可能对病毒的致病性起重要作用,与所致疾病临床类型相关。     

禽流感H5N1亚型病毒对五个不同品系小鼠致病性的比较

目的 比较了不同遗传背景小鼠对禽流感H5N1亚型病毒的致病敏感性,为H5N1禽流感模型制作和机理研究提供依据.方法 近交系BALB/c、C57BL/6和封闭群ICR、NIH Swiss和KM Swiss共五个不同品系小鼠.每个品系实验动物30只,分接毒组20只,空白对照组10只,每组雌雄各半.病毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1),经测定TCID50为10-4.875/mL.接毒组通过鼻腔接种0.1 mL病毒液,对照组接种正常鸡胚尿囊液.小鼠接毒后连续观察14 d,观察记录临床症状、体温、体重变化,对在实验期间死亡和实验14 d结束后仍然存活的小鼠均进行组织器官病理取材,进行RT-PCR病毒分离检测、HE染色及H5N1抗原特异性免疫组化染色.结果 ①临床症状:H5N1禽流感病毒能感染五个品系的小鼠,引起呼吸急促等症状和一过性体重、体温下降.②死亡情况:小鼠在接毒后第1天即出现死亡,死亡的高峰期集中在接毒后第3～6天.五个品系小鼠死亡率存在差异,BALB/c为70%,ICR为50%,NIH Swiss为40%,C57BL/6为25%,KM Swiss为10%;③病毒分离:各组接毒小鼠在死亡后均进行了病毒分离,死亡小鼠的肺脏均分离到病毒,其他脏器未分离到病毒.④病理变化:实验期间五个品系死亡小鼠肺脏病理改变相近.大体观:死亡小鼠肺部淤血,呈暗红色,体积增大,局部肺组织实变.镜下观:死亡小鼠的共同病理改变为间质性肺炎,具体表现为肺泡腔及间质出血、炎性细胞浸润;间质增生,肺泡隔增宽;肺泡腔中见纤维素性渗出,透明膜形成.⑤免疫组化结果:在死亡小鼠的气管上皮细胞和肺巨噬细胞可观察到H5N1禽流感病毒阳性表达.结论 小鼠作为H5N1禽流感病毒模型具有普适性,不同品系小鼠感染鹅源H5N1禽流感病毒的临床症状、病程和病理变化与人禽流感病例相似.不同品系小鼠的死亡比例有明显差别,可以根据不同的实验目的,选择不同品系的小鼠制作H5N1禽流感动物模型.不同品系的遗传特性对禽流感易感性产生明显的影响,遗传背景可能与H5N1禽流感病毒感染应答机理存在联系:BALB/c和C57BL/6均为近交系,其中BALB/c小鼠的品系特征之一表现为干扰素产量低,接种H5N1病毒后表现为高死亡率(70%),而C57BL/6小鼠的干扰素产量高,接种H5N1病毒后表现为低死亡率(25%),提示不同遗传背景小鼠的干扰素水平与H5N1感染致死具相关性.为进一步研究H5N1禽流感病毒易感性相关基因以及其与宿主免疫反应的关系提供了一个研究基础.     

B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

【摘要】 目的 本研究利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法 通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以105EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果 成功从体外拯救出B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性; 攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论 成功搭建B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究还较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。     

人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析

目的 对比分析人高致病H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒及H1N1流感病毒分别感染BALB/c小鼠后的机体反应特征。方法 分别以H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠存活率、体征变化及感染后肺组织病理损伤差异,检测小鼠感染流感病毒后肺组织增殖细胞核抗原（PCNA）表达并观察小鼠感染后修复状况。结果 H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒均感染BALB/c小鼠,小鼠存活率依次为H7N9>H1N1>H5N1,肺组织病理损伤严重程度依次为H5N1 >H1N1 >H7N9,PCNA表达水平依次为H7N9 >H1N1 >H5N1。结论 H7N9病毒感染后宿主炎症反应较小,感染后小鼠肺组织自我修复能力较强;H5N1病毒感染BALB/c小鼠后的机体反应最为强烈,感染后恢复能力差,致死率高。     

禽流感病毒感染BALB/c小鼠的动态病理观察

目的 将H5N1亚型禽流感病毒(AIV)鼻腔接种BALB/c小鼠,动态观察小鼠每个时期主要器官组织的病理变化.方法 将100μl H5N1亚型禽流感病毒原液滴入经麻醉后BALB/c小鼠鼻腔,观察14 d,每天取材1次,固定、包埋、切片后HE染色观察各组织病理变化.结果 H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠后,产生一系列与禽流感病毒感染有关的动态病理改变:第1～2天(前驱期),肺轻微出血、水肿、炎性细胞浸润;第3～7天(发作期),肺损伤逐渐严重,大量出血、炎性细胞浸润、严重水肿、淤血、肺泡实变塌陷或者气肿;第8～14天(恢复期),各种损伤逐渐减轻,出血渗出减少,水肿减轻,肺间质出现纤维化而趋于恢复正常.肝、肾、脑出现病理改变.结论 通过动态观察病理,弄清了禽流感病毒每个时期在BALB/c小鼠体内造成的病理损伤.     

2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)聚合酶PA、PB1和PB2编码基因的进化规律。方法:从NCBI流感病毒基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及人、猪和禽流感病毒相应的参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件比对和修剪此次流行株的代表序列及所有参考株序列并构建系统树,再比对和修剪此次流行株的代表序列及人A/H1N1病毒各年代(1918~2008年)参考序列并构建系统树,同时比对此次流行株的代表序列及人A/H1N1各年代(1918~2008年)参考序列编码PB2蛋白的氨基酸序列。结果:不同地区分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PB1和PB2编码基因均具有高度同源性,并聚集在一个独特的进化支上,与猪流感病毒对应基因接近。三者均与2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒基因(A/Iowa/CEID23/2005/H1N1)具有高度的相似性。2009年新型甲型H1N1流感病毒、2005年美国爱荷华州流行的H1N1 (DQ889682)病毒PB2蛋白第627位氨基酸与禽类流感病毒相同,均为谷氨酸,而与其他人A/H1N1 (1918~2008年)病毒的赖氨酸不同。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶基因可能来源于2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程。     

奥司他韦在树鼩体内的药动及药效学应用研究

目的探讨奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数特征,以及在树鼩体内的抗流感病毒药效作用。方法树鼩经口服磷酸奥司他韦后取血浆用于药代动力学分析,并与人、雪貂、小鼠、大鼠的药代动力学参数比较;树鼩经鼻接种感染人流感病毒A/California/04/2009 H1N1和禽流感病毒H9N2突变株Y280-PB2-E627K,给予奥司他韦治疗,观察鼻腔症状,收集感染后第1,3和5天鼻灌洗液及沉淀分别行病毒TCID50检测和细胞分类计数,检测感染后21 d血清中和抗体滴度。结果奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数为:Cmax:1. 34μg/m L,Tmax:0. 75h,T1/2:2. 03 h,AUC0-12:1. 76 mg·h/liter。奥司他韦对感染A/California/04/2009 H1N1病毒的树鼩鼻腔排毒抑制作用不明显,但高剂量组奥司他韦可明显抑制感染H9N2 Y280-PB2-E627K病毒树鼩第1天的鼻腔排毒,减少第3天鼻灌洗液中细胞总数。感染A/California/04/2009 H1N1病毒后产生的抗体效价明显高于H9N2 Y280-PB2-E627K禽流感病毒的抗体效价,奥司他韦抗病毒治疗对感染同一病毒各组间血清抗体效价无影响。结论奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数不同于人或雪貂等模型动物,但其药物血浆清除半衰期和达峰时间与小鼠相近;药效学方面奥司他韦可有效抑制感染H9N2 Y280-PB2-E627K流感病毒树鼩的鼻腔病毒排毒和炎症反应。     

H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性

目的进一步探讨H7N9禽流感病毒对哺乳动物的感染与致病能力,并对其分子机制进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过病毒全基因组测序及比对探寻适应的分子机制。结果禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒,经过在小鼠体内进行9次传代后,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因,NA基因以及PA亚基共发生了4个有义突变。结论禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒经连续传代后基因发生突变,但对病毒的毒力以及致病力影响仍需后续实验验证。     

禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病敏感性研究

目的观察禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病性。方法将NIH小鼠随机分为接毒组(20只)和对照组(10只),在负压感染实验室,接毒组于乙醚麻醉后给予AIVH5N1型病毒滴鼻,对照组予正常阴性尿囊液滴鼻,观察14d,记录小鼠的体温、体重、临床症状、死亡情况、病理变化、肺指数及抗体变化。结果 NIH小鼠感染禽流感H5N1型病毒后第1天就出现精神不振,病程主要集中在第3～7天,临床症状主要表现为弓背、蜷缩、竖毛、颤抖、反应迟钝、活动减少、爱扎堆,体重(下降)出现减轻,体温降低,死亡率为40%;接毒组死亡小鼠肺指数为(2.21±0.40),较对照组的(0.44±0.23)明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);肺组织病理严重改变,第8天才能检出抗体(OD值等于0.231)。结论禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠有一定的致病性。     

禽流感H5N1型病毒对沙鼠致病性的初步研究

目的 观察禽流感H5N1型病毒对沙鼠的致病性。方法 在生物安全三级实验室，将禽流感H5N1型病毒通过滴鼻接种乙醚麻醉后沙鼠，观察14d，记录沙鼠的体温、体重、临床体征、病理学变化、病毒分离情况及抗体变化。结果 沙鼠感染后发病主要表现在第2～6天，攻毒组沙鼠出现反应迟钝、皱毛、弓背、食欲下降、呼吸急促、打堆等体征，攻毒组沙鼠的体温降低和体重减轻，死亡率为44％，在攻毒后8d检出抗体，主要病理学变化表现为肺出现严重淤血、水肿、出血，镜下可见肺间质充血，血管周围炎性细胞浸润，肝和胸腺淤血，肾出血，肾小管变形。结论 禽流感H5N1型病毒对沙鼠有较强致病性。     

A Novel Reassortant H2N3 Influenza Virus Lsolated from China

Objective To analyze the genetic composition of a novel H2N3 virus isolate identified from a duck cage swab in a live poultry market （LPM） in 2009 in Guangdong province of China. Methods PCR-positive specimens were inoculated into embryonated chicken eggs and subtyped by conventional RT-PCR. All segments of the virus A/environment/Guangdong/2/2009 were sequenced, and phylogenetic trees were constructed and analyzed. Results The genes of this virus belong to Eurasian-lineage avian viruses. The virus is a reassortant with the HA gene from an H2N2 virus and the NA gene from an H5N3 virus. The PB1, PB2, and NP genes were from an H4N6 virus, the PA was from an H3N8 virus, the M gene was from an H1N3 virus, and the NS gene was from an H10N6 virus. Conclusion market. Its A novel avian-origin reassortant H2N3 influenza virus was detected in a live poultry potential impacts and evolution should be closely monitored.     

A Novel Reassortant H2N3 Influenza Virus Isolated from China

Objective To analyze the genetic composition of a novel H2N3 virus isolate identified from a duck cage swab in a live poultry market (LPM) in 2009 in Guangdong province of China.Methods PCR-positive specimens were inoculated into embryonated chicken eggs and subtyped by conventional RT-PCR. All segments of the virus A/environment/Guangdong/2/2009 were sequenced,and phylogenetic trees were constructed and analyzed.Results The genes of this virus belong to Eurasian-lineage avian viruses. The virus is a reassortant withthe HA gene from an H2N2 virus and the NA gene from an H5N3 virus. The PB1, PB2, and NP genes were from an H4N6 virus, the PA was from an H3N8 virus, the M gene was from an H1N3 virus, and the NS gene was from an H10N6 virus.Conclusion A novel avian-origin reassortant H2N3 influenza virus was detected in a live poultry market. Its potential impacts and evolution should be closely monitored.     

新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析,为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条,运用MEGA5．2．1软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化;应用Excel表格对氨基酸构成进行计算;运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别,系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成,系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株,并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后,这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。     

A Novel Reassortant H3N8 Influenza Virus Isolated from Drinking Water for Duck in a Domestic Duck Farm in Poyang Lake Area

ObjectiveTo conduct a full genome sequence analysis for genetic characterization of an H3N8 influenza virus isolated from drinking water of a domestic duck farm in Poyang Lake area in 2011.MethodsThe virus was cultivated by specific pathogen free (SPF) chicken embryo eggs and was subtyped into hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) by real-time PCR method. Eight gene segments were sequenced and phylogenetic analysis was conducted.ResultsThe NA gene of this virus belongs to North American lineage; other seven genes belong to Eurasian lineage. Compared with the viruses containing NA gene, the PB2 and PB1 gene came from different clades. And this indicates that the virus was a novel reassortant genotype. The HA receptor binding preference was avian-like and the cleavage site sequence showed a low pathogenic feature. There was no drug resistance mutation of M2 protein. The mutations of Asn30Asp, and Thr215Ala of the M1 protein implied the potential of pathogenicity increase in mice.ConclusionThe finding of novel genotype of H3N8 virus in drinking water in this duck farm near Poyang Lake highlighted the importance of strengthening the surveillance of avian influenza in this region, which could contribute to pinpointing the influenza ecological relations among avian, swine, and human.     

H7N9禽流感病毒对人类致病的分子基础分析

【目的】 了解H7N9禽流感病毒对人类致病的分子特征,为更好地预防与治疗H7N9人禽流感提供科学依据。【方法】 从GISAID数据库中下载中国2013年分离的所有H7N9禽流感病毒株的基因及蛋白序列,并从NCBI数据库中下载其他相关的流感病毒序列,运用生物信息学软件分析H7N9禽流感病毒基因的系统进化特征?受体结合位点?宿主特异位点?飞沫传播关键氨基酸位点?致病及毒力相关位点?耐药性位点及潜在糖基化位点等的变异情况。【结果】 2013年中国流行的H7N9禽流感病毒为四源重组病毒, 所有基因片段均来源于禽类,不含任何人流感病毒基因;病毒HA的受体结合位点发生了2个关键氨基酸的变异(G186V和Q226L);在与飞沫传播有关的关键氨基酸位点中,个别氨基酸已发生了变异(T160A? Q226L);该病毒具有8个毒力增强位点;所有分离株的M2均发生了 S31N变异;分离株A/Shanghai/1/2013的NA的耐药位点发生了R294K变异;所有毒株的潜在糖基化位点均相对保守。【结论】 H7N9禽流感病毒为四源重组的新型禽流感病毒。该病毒具有与人呼吸道上皮细胞SAa-2,6 Gal受体结合的分子基础,但目前尚未获得经飞沫传播的充分条件,人传人的可能性不大。该病毒具有低致病性禽流感病毒的分子特征,表明对禽类致病性不强,但其对人类呈高致病性,这可能与其毒力位点的特征有关。所有分离毒株均发生了对离子通道抑制剂金刚烷胺类药物的耐药性突变,个别毒株已发生了对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(达菲)的耐药性突变。