人原发性肝癌基因治疗的实验研究：肿瘤坏死因子基因的初步应用

将含人肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ的不同逆转录病毒载体（ＬＮＳ－ｔｎｆα、Ｌ－ｔｎｆαＳＮ及ＬＮＣ－ｔｎｆα）和质粒型真核细胞载体（ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα），分别用磷酸钙法导入肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１中，观察ＴＮＦ的表达水平。结果：重组质粒型表达载体ｐＳＶＫ３－ｔｎｆα表达好，２４小时开始分泌ＴＮＦα（５０Ｕ／ｍｌ），４８￣７２小时达最高值（９０Ｕ／ｍｌ），９６小时后下降（４０Ｕ／ｍｌ）。将ｐ     

肿瘤坏死因子对恶性肿瘤蛋白质代谢和细胞周期动力学的影响

Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠皮下接种Ｗａｌｋｅｒ２５６癌肉瘤细胞后，连续３天腹腔内注射重组人肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ）之后，分别切取肿瘤进行细胞周期动力学测定和蛋白质代谢分析。结果表明，ＴＮＦ治疗组肿瘤体积和重量显著减少，肿瘤蛋白分段合成率（２５．３％±３．５％·ｄ－１，对照组４２．９％±２．７％·ｄ－１，ｐ＜０．０１）、蛋白合成率（０．２０±０．０５ｇ·ｄ－１，对照组１．１４±０．２０ｇ·ｄ－１，Ｐ＜０．００１）和分段生长率（２４．３％±２．１％·ｄ－１，对照组３５．８％±２．３％·ｄ－１，Ｐ＜０．０１）均显著降低，肿瘤蛋白分段降解率则无明显改变。流式细胞仪测定表明，ＴＮＦ治疗组在５’－溴脱氧尿苷注射６小时后，肿瘤细胞标记指数（３０．８％±４．２％，对照组４４．７％±４．２％，Ｐ＜０．０１）和Ｇ１期增长率（６．０％±１３％，对照组１２．２％±２．５％，Ｐ＜０．０１）均显著减少，相对移动率无明显改变。研究结果提示，ＴＮＦ在荷瘤大鼠中抗肿瘤作用的代谢机理，在于减少肿瘤细胞ＤＮＡ和肿瘤蛋白质的合成，从而抑制肿瘤的生长。     

肿瘤放射线诱导性TNF基因疗法的实验研究

肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）对机体具有一定的放射线保护作用，并能增强肿瘤的放疗效果。用可被放射线转录激活的Ｅｇｒ－１启动子与人ＴＮＦ的融合基因，构建成放射线诱导性的人ＴＮＦ双拷贝逆转录病毒载体ｐＥＴＤＣ，经包装细胞Ｐｓｉ－２和Ｃｒｉｐ的两次包装后，其病毒上清的病毒滴度达４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ。用此病毒上清感染小鼠成纤维细胞株ＮＩＨ３Ｔ３和黑色素细胞株Ｂ１６．Ｆ１０，经Ｇ４１８抗性筛选后，得到的阳性克隆分泌ＴＮＦ量分别为２．１ｎｇ／ｍｌ和１．１ｎｇ／ｍｌ，并经ＲＴ－ＰＣＲ证实了人ＴＮＦｍＲＮＡ的表达。经２０Ｇｙ的放射线体外照射后，其ＴＮＦ表达量分别升至１３．８ｎｇ／ｍｌ和５．７ｎｇ／ｍｌ，即分别为照射前的５．６倍和４．２倍。此结果为其将来瘤体内注射该ＴＮＦ基因表达载体并辅助局部放疗的体内实验打下了基础。     

肿瘤病人若干免疫功能的观察

用酶联法、同位素掺入法、同位素释放法等检测肿瘤病人血清ｓＩＬ－２Ｒ、ＴＮＦ、ＮＫ细胞活性、ＬＡＫ细胞活性、淋巴细胞转化及淋巴细胞对ＩＬ－２的反应性等免疫功能。结果表明：肿瘤病人血清ｓＩＬ－２Ｒ（２４１．９±１７２．５ｐｍｏｌ／Ｌ）及ＴＮＦ（１．８６±１．５２ｎｇ／ｍｌ）含量均显著高于健康对照组（分别为：１３４．２±７６．５ｐｍｏｌ／Ｌ，Ｐ＜０．０５～０．００５，０．６３±０．２０ｎｇ／ｍｌ）；而肿瘤病人ＮＫ细胞活性（１１．１８±６．９８）、ＬＡＫ细胞活性（１７．８６±９．５７）、淋巴细胞转化（３２．８３±５２．５９）及淋巴细胞对ＩＬ－２的反应性（５．９４±９．３１）等均显著低于健康对照组（分别为：２０．３３±１０．９７，３８．４９±８．１０，７５．７０±５２．６５和２４．５９±２８．２５，Ｐ＜０．０４～０．００１）。结果提示：肿瘤病人存在着多种免疫功能的改变，故应给予合理的过继免疫治疗。     

肿瘤坏死因子,干扰素和免疫活性肽对癌瘤患者骨髓粒—巨造血祖细…

应用ＣＦＵ－ＧＭ软琼脂培养技术，在体外观察了不同浓度的ｒｈ－ＴＮＦ，ｒｈ－ＩＦＮα－２和ＩＡＰ对９例恶性淋巴瘤和１例睾丸癌患者的骨髓粒、巨造血祖细胞生长的影响。结果表明，在培养体系中，加入ｒｈ－ＴＮＦ５０和１００ｕ／ｍｌ，其ＣＦＵ－ＧＭ较空白对照均明显增多（Ｐ〈０．０５）。ｒｈ－ＩＦＮα－２１０００ｕ／ｍｌ可使ＣＦＵ－ＧＭ减少（Ｐ〈０．０５）。ＩＡＰ似乎对ＣＦＵ－ＧＭ无影响（Ｐ〉０．０５）。集落形     

成纤维细胞介导的人α型干扰素基因疗法与过继免疫化疗联合治疗人肝癌的实验研究

作者以皮下接种人肝细胞癌细胞ＳＭＭＣ７７２１的裸鼠为荷瘤模型，由人外周血单个核细胞经体外ＩＬ－２和丝裂霉素Ｃ灭活的人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１共同刺激培养后激活的杀伤细胞（ＡＫ），研究了将成纤维细胞介导的人ＩＦＮ－α基因疗法与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素过继免疫化疗联合应用后对肝癌的治疗作用。结果表明：（１）给肝癌裸鼠单独腹腔埋植人ＩＦＮ－α基因转移的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋）就能显著抑制肝癌（皮下）体内生长，使荷瘤裸鼠存活期明显延长；（２）在腹腔埋植ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋之后再静脉注射ＡＫ细胞、腹腔内注射ＩＬ－２，发现荷瘤裸鼠的皮下肿瘤结节生长抑制作用更明显；（３）将ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α￣＋与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素联合应用后，对肝癌裸鼠的治疗效果更佳。     

肿瘤坏死因子、干扰素和免疫活性肽对癌瘤患者骨髓粒－巨造血祖细胞的影响

应用ＣＦＵ－ＧＭ软琼脂培养技术，在体外观察了不同浓度的ｒｈ－ＴＮＦ，ｒｈ－ＩＦＮα－２和ＩＡＰ对９例恶性淋巴瘤和１例睾丸癌患者的骨髓粒－巨造血祖细胞生长的影响。结果表明，在培养体系中，加入ｒｈ－ＴＮＦ５０和１００ｕ／ｍｌ，其ＣＦＵ－ＧＭ较空白对照均明显增多（Ｐ＜０．０５）。ｒｈ－ＩＦＮα－２１０００ｕ／ｍｌ可使ＣＦＵ－ＧＭ减少（Ｐ＜０．０５）。ＩＡＰ似乎对ＣＦＵ－ＧＭ无影响（Ｐ＞０．０５）。集落形态学显示，ｒｈ－ＴＮＦ和ＩＡＰ均能增加巨噬细胞为主形成的集落（Ｐ＜０．０１）。我们认为，该实验为骨髓移植及肿瘤患者在选择应用这些细胞因子上提供了一定的佐证。     

TNF与U937细胞的bcl—2基因表达及细胞周期的关系

目的：探讨肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）与白血病Ｕ９３７细胞的ｂｃｌ－２基因表达和细胞周期的关系。方法：首先用ＴＮＦ处理Ｕ９３７细胞，提取小片段ＤＮＡ进行ＤＮＡ断裂分析，继而用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓ－Ｐ免疫组化染色法检测Ｕ９３７细胞的ｂｃｌ－２基因表达变化，并通过流式细胞术分析ＴＮＦ对Ｕ９３７细胞的ＤＮＡ含量和细胞周期的影响。最后，用磷酸钙沉淀法将ｂｃｌ－２基因转染到Ｕ９３７细胞，经Ｇ４１８筛选稳定转染子，用不     

腹腔注射分泌粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子的重组痘苗病毒的…

通过体内途径直接注射各种载体进行细胞因子基因治疗，具有重要的临床意义，作观察了表达小鼠粒细胞－巨噬细胞落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因的重组痘苗病毒９ＶＶＧＭ－ＣＳＦ）对肺转移荷瘤小鼠模型的治疗作用。给Ｃ５７ＢＬ／６小鼠尾静脉注射２×１０＾５Ｂ１６Ｆ１０细胞３天后开始腹 内注射ＶＶＧＭ－ＣＳＦ１０＾８ＰＦＵ／０．１ｍｌ，２粗埽瘟疲仓堋＝峁允荆郑郑牵停茫樱颇芄幌灾跎俸闪鲂∈笙赴纳鄙恕     

苦马豆素抑制胃癌生长及转移的实验研究

目的研究苦马豆素（α甘露糖苷酶Ⅱ抑制剂－ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ,ＳＷ）对宿主的免疫调理作用及其对胃癌生长及转移的抑制作用。方法给胃癌裸鼠原位种植模型饲养含ＳＷ３μｇ／ｍｌ饮水,每间隔２天换饲普通饮水２天,８周后处死实验动物,测量肿瘤大小,观察转移情况,测定脾细胞总数、脾细胞及外周血淋巴细胞ＮＫ活性。结果ＳＷ组肿瘤体积为０．４２±０．２６ｃｍ３,明显小于对照组１．６０±０．３６ｃｍ３,抑瘤率达７３．８％（Ｐ＜０．０１）;ＳＷ组肝及腹膜转移率（２０％、３０％）均明显低于对照组（８０％、９０％）,抑制率分别达到７５．０％和６６．７％（Ｐ＜０．０１）。饲ＳＷ饮水后,裸鼠脾细胞总数明显增加,外周血淋巴细胞ＮＫ活性明显升高,脾细胞ＮＫ活性亦明显升高。结论ＳＷ有抑制人胃癌在裸鼠体内生长和转移的作用,这一作用可能有免疫反应参与     

人His6—IFNhγ／TNFβ（His6—γTNFβ）融合蛋白（包涵体）的 …

应用ｐＥＴ２８（含Ｔ７ｌａｃ启动子和Ｈｉｓｔ－ｔａｇ）质粒，将人γＴＮＦβ融合基因之组建成ｐＥＴγＬＴ表达质粒，并转化于Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。本文对ｐＥＴγＬＴ／ＢＬ２１（ＤＥ３）工程菌的Ｈｉｓ６－γＴＮＦβ重组产物进行了诱导表达，分离纯化的研究。结果表明，该工程菌用ＬＢ培养基在３７℃扩增至ＯＤ５９０为０．５左右，加ＩＰＴＧ（终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ）诱导５小时，此时Ｈｉｓ６－γＴＮＦβ的     

鼻咽癌中p53基因突变的研究

目的：探讨鼻咽癌中ｐ５３基因突变情况。方法：用非同位素不对称ＰＣＲ－单链构象多态性技术（ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ），分析了鼻咽癌活检组织、细胞株和裸鼠移植瘤中ｐ５３基因第５、６、７和８外显子（ｅｘｏｎ）的基因突变，并对其中ｅｘｏｎ８突变的ＳＵＮＥ－１和ＳＵＮＴ－１进行ＤＮＡ测序。结果：在２０例鼻咽癌活检组织中没有发现突变；但在鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１、ＣＮＥ２、ＳＵＮＥ－１和瘤株ＳＵＮＴ－１中存在第８外显子突变，而ＨＫ１为第５外显子突变。ＤＮＡ测序发现ＳＵＮＥ－１和ＳＵＮＴ－１的突变点在ｅｘｏｎ８的密码子（ｃｏｄｏｎ）２８０上，由ＡＧＡ（精氨酸）→ＡＣＡ（苏氨酸）。结论：ｐ５３基因突变热点的ｅｘｏｎ５、６、７和８可能在鼻咽癌变过程中没有重要意义，而在裸鼠移植瘤和细胞株建立过程中起重要作用。ＥＢＶ由于和鼻咽癌的关系密切，在鼻咽癌中可能存在ＥＢＶ编码蛋白与ｐ５３结合或蛋白表达被ＥＢＶ抑制等其他途径使ｐ５３失活。     

新城鸡瘟病毒诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的细胞毒活性研究

目的观察新城鸡瘟病毒Ｌ系（ＮＤＶ－Ｌ）诱导小鼠腹腔巨噬细胞（ＰＥＭΦ）产生的肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）对肿瘤细胞的细胞毒性作用。方法采用噻唑蓝（ＭＴＴ）和３Ｈ－脱氧胸苷（３Ｈ－ＴｄＲ）标记肿瘤细胞的方法。结果ＮＤＶ－Ｌ可诱导小鼠ＰＥＭΦ产生ＴＮＦ－α，其产生的量随ＮＤＶ－Ｌ感染量的增加而活性增强。当ＮＤＶ－Ｌ感染剂量一定时，ＴＮＦ－α释放量在ＮＤＶ－Ｌ作用ＰＥＭΦ２４ｈ时为最强（１００Ｕ／ｍｌ）。用３Ｈ－ＴｄＲ标记肿瘤细胞（小鼠乳腺癌细胞系Ｃａ７６１－８６和小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５）做ＴＮＦ－α的细胞毒试验，表明其具有明显的杀伤活性。结论ＮＤＶ－Ｌ诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生的ＴＮＦ－α具有明显的细胞毒活性。     

胃癌多基因表达的同步检测

应用ＬＳＡＢ和ＡＢＣ法对７５例胃癌及癌旁组织进行了ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＥＧＦＲ和ｒａｓ表达的研究。结果显示：（１）７５例胃癌ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＥＧＦＲ和ｒａｓ表达阳性率分别为４１．３％、１８．７％、６１．３％和４６．７％。ｐ５３在肠型胃癌中阳性率为５２．６％，高于弥漫型胃癌的２９．７％（Ｐ＜０．０５）；在早期胃癌中阳性率较高（６０．０％），癌旁重度异型增生亦有阳性表达（２／４）。ｃ－ｅｒｂＢ－２阳性表达只限于癌灶，而癌旁组织均为阴性。ｃ－ｅｒｂＢ－２在高分化胃癌中阳性率较高（Ｐ＜０．０５）。ＥＧＦＲ表达与胃癌的大体类型、生长方式、分化程度、淋巴结受累和远处转移呈正相关（Ｐ＜０．０５）。（２）ｃ－ｅｒｂＢ－２和ＥＧＦＲ在胃癌中的表达互相独立。（３）ｒａｓ表达与ＥＧＦＲ表达呈正相关，而与ｃ－ｅｒｂＢ－２呈负相关。（４）ｐ５３表达与其它基因表达无明显关系。上述结果表明，胃癌发生发展过程中伴有多种癌基因的变化，其出现时间不同，意义也不一样。     

多发性骨髓瘤患者血清IL—6和TNF—α水平的测定及其意义

目的 探讨多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者血清白细胞介素６（ＩＬ－６）和肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）的变化及其意义。方法 采用ＥＬＩＳＡ法测定３６例ＭＭ患者血清中ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的水平。结果 进展期ＭＭ患者血清ＩＬ－６和ＴＮＦ－α水平较正常对照组明显增高（Ｐ〈０．０１）;缓解期ＭＭ患者血清ＩＬ－６和ＴＮＦ－α水平明显下降,与正常对照组相比无显著性差异（Ｐ〉０．０５）。进展期ＭＭ患者ＩＬ－６和ＴＮＦ－α水     

肺癌患者血清sIL－2R和TNF－α的检测及其临床意义

分析了７３例原发性肺癌患者治疗前后（手术切除１６例，放疗２８例，化疗２９例）血清ｓＩＬ－２Ｒ和ＴＮＦ－α的变化。结果表明：（１）ｓＩＬ－２Ｒ和ＴＮＦ－α均显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１），肿瘤越晚期升高越明显（Ｐ＜０．００１）；（２）治疗后ｓＩＬ－２Ｒ和ＴＮＦ－α都明显下降（Ｐ＜０．０１）．但各治疗组下降程度不同，放、化疗组比手术切除组下降更显著；（３）ｓＩＬ－２Ｒ和ＴＮＦ－α在肺癌病人呈正相关（ｒ＝０．３４），机理不明。结果提示，血清ｓＩＬ－２Ｒ和ＴＮＦ－α可作为肺癌患者免疫功能的监测指标之一，并可作为疗效判断的参考。     

胃癌病人血清3种细胞因子测定及其临床意义探讨

目的 探讨胃癌病人血清肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）、白细胞介素６（ＩＬ－６）和白细胞介素８（ＩＬ－８）水平的变化及其临床意义。方法 采用ＥＬＩＳＡ法测定３５例胃癌病人血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－６和ＩＬ－８水平,并与胃良性肿瘤组和正常对照组进行比较分析。结果 胃癌病人血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－６和ＩＬ－８水平明显增高（Ｐ〈０．０１）,并与临床期有关（Ｐ〈０．０５）,病灶切除后血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－６和ＩＬ－     

成纤维细胞介导的人α型干扰素基因疗法与过继免疫化疗联合治…

作者以皮下接种人肝细胞癌细胞ＳＭＭＣ７７２１的裸鼠为荷瘤模型，由人外周血单个核细胞经体外ＩＬ－２和丝裂霉素Ｃ灭活的人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１共同刺激培养后激活的杀伤细胞（ＡＫ），研究了将成纤维细胞介导的人ＩＦＮ－α基因疗法与ＩＬ－２／ＡＫ／阿霉素过继免疫化疗联合应用后对肝癌的治疗作用。结果表明：（１）给肝癌鼠单独腹腔埋植人ＩＦＮ－α基因转移的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＦＮ－α＾＋）就     

小鼠移植性肿瘤血清中γ－GT和α1—AT活性的检测

本文测定了ＨｅＰＡ与Ｓ１８０小鼠血清中γ－６Ｔ和α１—ＡＴ活性。γ－６Ｔ活性：正常鼠为１９．３３±４．８７ｍＩＵ／ｍｌ；移植第５及第１０天Ｓ１８０的值分别为１０．３２±３．９０，９．７８±２．８６ｍＩＵ／ｍｌ；第５及第１０天ＨｅｐＡ的值分别为１３．１５±３．１７，１１．８１±２．７５ｍＩＵ／ｍｌ，均比正常鼠显著降低（Ｐ＜０．００１）。α１—ＡＴ活性：正常鼠每分钟为１．９２７±０．１８５μｍｏｌ／ｍｌ，移植第５及策１０天Ｓ１８０的值每分钟分别为１．５７５±０．２０４μｍｏｌ／ｍｌ，１．４１２±０．２１７μｍｏｌ／ｍｌ；第５及第１０天ＨｅｐＡ的值每分钟分别为１．３８７±０．２４４，１．１７９±０．１７９μｍｏｌ／ｍｌ，均比正常降低（Ｐ＜０．００１）。肿瘤病程与γ—ＧＴ，α１—ＡＴ活性呈负相关。     

原发性肝癌肿瘤血管密度及其表达的临床病理意义

目的研究肿瘤微血管密度（ＭＶＤ）和肿瘤血管生长因子（ＶＥＧＦ）的表达水平在原发性肝癌中的临床病理意义。方法对６３例手术切除的小肝癌（直径＜５ｃｍ）患者的临床病理资料进行了回顾性的研究。其中２年内转移复发组２９例,２年内无转移复发组３４例。每例取３张连续的切片分别进行ＨＥ染色、ＶＥＧＦ和生物素标记的荆豆凝集素Ｉ（Ｂｉｏ－ＵＥＡ－Ｉ）的免疫组化染色。根据Ｂｉｏ－ＵＥＡ－Ｉ染色的血管内皮细胞计数来测定ＭＶＤ。结果转移复发组和无转移复发组的ＭＶＤ分别为４９．６±２９．７、２２．７±２８．２（Ｐ＜０．０１）;转移复发组和无转移复发组的ＶＥＧＦ阳性率分别为８６．２％（２５／２９）、４７．１％（１６／３４）,两者差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。两组在肿瘤分期、有无卫星灶、有无门脉癌栓３方面差异也具有显著性（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）。结论除肿瘤分期、卫星灶、门脉癌栓具有预后意义外,肝癌组织中ＭＶＤ和ＶＥＧＦ的表达也具有预后价值