C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

带FLAG标签小鼠HuR真核表达载体的构建及其生物学功能的鉴定

目的 构建人抗原R (HuR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达并初步分析其生物学功能.方法 提取NIH3T3细胞总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到小鼠HuR编码序列,酶切后克隆至pcDNA3.1-FLAG载体;重组载体经PCR、酶切、测序鉴定正确后瞬时转染NIH3T3细胞,采用W...     

转甲状腺素蛋白真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建转甲状腺素蛋白(TTR)的真核表达载体,观察其在NIH 3T3细胞中的表达及定位.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到TTR编码序列,将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-TTR-HA.重组质粒通过PCR、酶切测序等证明构建正确后经脂质体转染NIH 3T3细胞,固定并染色后通过荧光显微镜观察该融合蛋白的表达及定位.结果 重组质粒经鉴定证明构建正确.转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要分布在细胞质中.结论 成功构建带HA标签的TTR真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为深入研究TTR在细胞内的相关生物学功能奠定了基础.     

小鼠ATP酶β亚单位真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况。方法取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上。采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质。结论成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

高迁移率族蛋白HMGB2的细胞内定位及移位研究

目的 观察鼠高迁移率族蛋白B2(HMGB2)在真核细胞中的定位和移位情况.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到HMGB2编码序列.然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒命名为pcDNA3-HA-HMGB2,随后将其转染NIH 3T3细胞.荧光显微镜观察仅转染质粒的细胞和质粒转染与亚砷酸钠刺激30min和1h后细胞内HA-HMGB2融合蛋白的定位及移位情况.结果 重组质粒经酶切、聚合酶链反应(FCR)和测序鉴定证明构建正确,并在NIH 3T3细胞中得到大量表达.荧光显微镜观察发现,FIA-HMGP2蛋白主要分布于细胞核中,经亚砷酸钠刺激后30min,部分细胞中的蛋白从胞核移位到胞质,刺激1h后蛋白则主要分布于胞质中.结论 成功构建带HA标签的HMGB2真核表达载体.该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位、移位,为下一步深入研究HMGB2作用细胞的信号通路提供了一个重要工具.     

小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

线粒体抗病毒信号蛋白MAVS真核表达质粒的构建及表达

目的:构建线粒体抗病毒信号蛋白(mitoehondrial antiviral signaling protein,MAVS)真核表达质粒.方法:从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得MAVS的全长cDNA双链片段.经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆进行测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-MAVS.借助脂质体转染peDNA3/flag-MAVS质粒到HEK293T细胞中,用Westem印迹检测目的蛋白的表达.同时用β干扰素的荧光素酶报告基因(IFN-β-luc)检测MAVS蛋白活性.结果:Western印迹实验证明pcDNA3/flag-MAVS可以在HEK293T细胞中表达MAVS,并且能使IFN-β报告基因活性明显增强.结论:构建了重组质粒peDNA3/flag-MAVS,在细胞中表达MAVS后具有刺激IFN-β转录的生物活性.     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

构建人补体膜辅助调节蛋白真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH 3T3细胞

目的：构建人补体膜辅助调节蛋白（membrane cofactor protein，MCP）真核表达载体并利用壳聚糖（Chitosan）转染小鼠NIH 3T3细胞。方法：应用PCR方法，从MCP-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB-MCP真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH 3T3细胞，并对转染细胞进行抗MCP免疫组织化学染色。结果：MCP基因大小为1065bp，与Genebank中记载的人MCP cDNA序列结果基本一致；抗MCP免疫组织化学染色显示转染细胞胞浆弥漫阳性。结论：成功构建了人MCP真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH3T3细胞，为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。     

鼠NF～IL～6反义真核表达载体的构建和鉴定

目的构建包含鼠细胞转录因子白介素6(NF～IL6)反义基因的部分功能区的重组反义真核表达载体pcDNA3.0/NF～IL6,为进一步研究鼠巨噬细胞中NF～IL6的功能奠定基础。方法 Trizol试剂法提取体外分离培养的鼠巨噬细胞总RNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT～PCR)扩增NF～IL6基因目的片段,PCR产物及真核表达载体pcD-NA3.0分别双酶切并进行连接,转化入大肠杆菌Ecoli Dh5α扩增后获得重组载体。结果 RT～PCR获得预期大小的特异性NF～IL6 DNA片段,经PCR、双酶切及测序分析证实已将鼠NF～IL6 cDNA片段正确的反向插入真核表达载体中。结论成功获得反义pcDNA3.0/NF～IL6重组质粒。     

重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

目的 探讨重组真核表达质粒pcDNA3.1/人TSH受体（hTSHR）体外转染TSHR表达下降的低分化滤泡状甲状腺癌细胞株后,细胞摄取放射性碘功能以及甲状腺癌相关基因mRNA表达 的变化.方法 pcDNA3.1/hTSHR转化DH5a感受态菌,进行扩增、酶切,再以核苷酸测序方法鉴定.体外转染pcDNA3.1/hTSHR,通过免疫荧光检测TSHR表达产物,井型γ计数仪检测摄碘率,相对定量实时荧光PCR验证其表达的TSHR蛋白功能和特性.采用SPSS 13.0软件,对计量资料行t检验.结果pcDNA3.1/hTSHR经PCR扩增hTSHR-cDNA片段约113 kb,Kpn Ⅰ和Xha Ⅰ双酶切：hTSHR-cDNA的片段约2.3 kb,pcDNA3.1（＋）的片段约5.5 kb,均同预期片段大小相符;核苷酸测序方法鉴定测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.在hTSH刺激下,转染pcDNA3.1/hTSHR细胞与转染pcDNA3.1（＋）细胞比较：（1）在甲状腺肿瘤细胞胞质、胞膜有增强的绿色荧光,（2）前者125 I摄取率是后者的2.9倍（t=28.63,P＜0.01）,（3）甲状腺碘摄取相关基因TSHR、钠碘转运体（NIS）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、Tg的mRNA的表达分别升高1.74倍（t=5.959,P＜0.01）、7.2倍（t=3.807,P＜0.05）、2.88倍（t=4.769,P＜0.01）和2.67倍（t=6.388,P＜0.01）.结论 pcDNA3.1/hTSHR体外转染甲状腺癌肿瘤细胞后,可有效提高碘的摄取;这可为放射性碘治疗失分化甲状腺癌提供新的实验依据.     

GRP78在HepG2细胞的亚细胞定位及真核表达

目的 构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.方法采用激光共聚焦显微镜观察GILP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78 cDNA序列,构建真核表达载体peDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.结果 GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布.双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白.结论 正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达.pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具.     

新的白血病相关基因LRP15真核表达载体构建及在K562细胞中的表达

 目的构建LRP15基因开放阅读框架(ORF)序列的真核表达载体,并观察其在K562细胞中的表达情况.方法采用RT-PCR方法自1例白血病患者中克隆LRP15cDNA片段,将目的基因LRP15克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LRP15.脂质体介导法将其转染K562细胞,72 h以RT-PCR方法检测转染细胞中LRP15基因的表达情况.结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人LRP15基因ORF序列;转染实验表明LR15基因能在K562细胞中表达.结论成功构建LRP15基因真核表达载体,并在K562细胞中获得表达,为进一步研究LRP15基因的功能奠定了基础.