重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

Objective To investigate the changes of iodide uptake and the expression of thyroidspecific genes in poorly differentiated follicular thyroid carcinoma (FTC) cells after transfection of human TSH receptor (hTSHR) gene in vitro. Methods The recombinant eukaryotic expression plasmid PcDNA3. 1/hTSHR-cDNA was transformed into DH5a bacterial for amplification and then the recombinant plasmid was extracted. The recombinant was identified with PCR amplifying, restriction enzyme digestion analysis and DNA sequencing. The recombinant plasmid pcDNA3.1/hTSHR was transfected into FTC-133 cell line by lipofectin methodin vitro. Immunofluorescence, iodide uptake studies and real time-PCR were applied to detect target protein expression. Statistical analysis was performed with t-test using SPSS 13. 0 software. Results Kpn Ⅰ and Xba Ⅰ restriction enzyme digestion, PCR amplifying and DNA sequencing confirmed that pcDNA3. 1/hTSHR was successfully constructed. After transfection of the recombinant plasmid pcDNA3. 1/hTSHR-cDNA and the stimulation of hTSH, the tumor cells displayed the expression of hTSHR protein at cell surface and cytoplasm. The iodine uptake in pcDNA3. 1/hTSHR transfected cells was 2. 9 times higher than that of control(pcDNA3.1(+) transfected cells) group(t = 28.63, P ＜0. 01). The expression of TSHR,NIS, TPO and Tg (mRNA levels) in pcDNA3. 1/hTSHR transfected cells were also significantly elevated by 1.74 (t =5.959, P＜0.01), 7.2 (t =3.807,P＜0.05), 2.88 (t=4.769,P＜0. 01) and 2.67 times (t=6.388,P ＜0.01) respectively compared to those of the control group. Conclusion The study demonstrates that iodide uptake may be reactivated by hTSHR receptor gene transfection in poorly differentiated FTC cell.     

促甲状腺激素受体与甲状腺癌关系的研究进展

甲状腺癌的预后一般较好,但在核素治疗过程中会有30％的患者发生失分化,失分化甲状腺癌由于不能有效摄取131I而缺少有效的治疗手段,其10年生存率可降至30％～40％.近年来的研究表明:促甲状腺激素受体( TSHR)基因与甲状腺癌的恶性表型有关,分化型甲状腺癌中TSHR基因表达降低,失分化甲状腺癌中TSHR基因表达沉默;体外实验将TSHR基因转染入甲状腺癌细胞株中,在促甲状腺激素刺激下可促进摄碘基因的表达并提高甲状腺癌细胞的摄碘率.由此可知,TSHR基因对于甲状腺癌的发生发展及核素治疗有重要意义.该文回顾了TSHR的基因、蛋白结构以及其在正常甲状腺组织中的作用,刘TSHR在甲状腺癌发生发展中的作用及参与的信号传导等方面进行了叙述,对TSHR基因沉默在失分化甲状腺癌中的作用进行了分析.     

BALB/c小鼠格雷夫斯病模型的构建

目的 通过免疫电穿孔的方法,构建稳定的BALB/c小鼠（简称小鼠）格雷夫斯病（GD）模型.方法 制备重组质粒pcDNA3.1/TSHR268.将50只小鼠按随机数字表法分为实验组（30只）、对照组（10只）和空白组（10只）.分别于实验第1、4、7、10周在实验组小鼠双后肢腓肠肌注射重组质粒,在对照组及空白组小鼠相同位置注射相同体积生理盐水;实验组及对照组小鼠每次注射后在注射区域行电穿孔加强免疫.以放射免疫法检测小鼠血清T4,ELISA法检测小鼠TRAb氨基端（TRAb N）抗体和TRAb羧基端（TRAb C）抗体.对模型小鼠进行甲状腺^99Tc^mO4^-显像及甲状腺形态学、病理学分析.多组间均数比较采用单因素方差分析及最小显著差异t检验.结果 实验组建模成功率为80％（24/30）.24只成功建模的BALB/c小鼠血清T4由第0周的（16.06±5.16） nmol/L升高至第12周的（95.04±68.92） nmol/L（F=18.906,t=-5.598,P＜0.05）,TRAb N抗体由第0周的（0.006±0.002） U/L升高至第12周的（0.251±0.110） U/L（F=47.491,t =-10.869,P＜0.05）,TRAbC抗体由第0周的（11.176±2.635） ×10^3任意单位（AU）/L升高至第12周的（46.395±22.001）×10^3 AU/L（F=14.642,t=-7.787,P＜0.05）.停止免疫后的第18周,小鼠血清T4为（36.64±23.68） nmoL/L、TRAb N抗体为（0.094±0.053） U/L、TRAb C抗体为（24.456±6.725）×10^3 AU/L,均有所下降,但仍明显高于免疫前水平（t=-4.161、-8.085和-9.008,均P＜0.05）.对照组与空白组小鼠T4、TRAb N抗体及TRAb C抗体在免疫前后均未见明显变化.经过4次免疫,实验组小鼠甲状腺对^99Tc^mO4^-的摄取能力较对照组及空白组明显增强.GD模型小鼠甲状腺较正常BALB/c小鼠体积增大,病理学检查可见甲状腺组织淋巴细胞浸润.结论 重组质粒pcDNA3.1/TSHR268＋免疫电穿孔方法可成功构建BALB/c小鼠GD模型.     

hTPO和hNIS共转染胶质瘤细胞U251介导放射性碘摄取的研究

目的 将人甲状腺过氧化物酶（hTPO）基因及人钠/碘同向转运体（hNIS）基因共转入胶质瘤细胞系U251后,研究其摄碘能力的变化.方法 克隆、重组、包装并扩增纯化得到重组腺病毒（AdTPO）,测定病毒滴度,Western-Blotting检测重组腺病毒的表达.使用脂质体转染法将hNIS基因转染入人胶质瘤细胞系U251中,经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞系（hNIS-U251）,为hNIS-U251组;使用重组腺病毒将hTPO基因转导入hNIS-U251中,使胶质瘤细胞获得hTPO基因（AdTPO-hNIS-U251）,为AdTPO-hNIS-U251组;未转入hTPO和hNIS的细胞为对照组（U251）.然后进行3组稳定表达细胞系体外摄125I实验及体外125I外流实验.3组间两两比较用q检验（Newman-Keuls法）.结果 AdTPO-hNIS-U251细胞、hNIS-U251细胞和U251细胞所摄取125I分别为（74 647.53±3605.88）、（55 769.96±4353.26）和（507.67±57.69）计数/min,3组间差异有统计学意义（F=836.17,P＜0.01）.AdTPO-hNIS-U251组较对照组（U251）摄125I能力增高约147倍（q=55.64,P＜0.01）,hNIS-U251组较对照组（U251）摄碘能力增高约110倍（q=41.47,P＜0.01）.AdTPO-hNIS-U251组较hNIS-U251组高约1.3倍（q=14.17,P＜0.01）.在体外125I外流实验中证实AdTPO-hNIS-U251组125I外流减慢,其有效半衰期延长至13 min.结论 将hTPO和hNIS基因共转染至胶质瘤细胞系U251后,能有效提高U251的摄碘能力.     

人钠/碘同向转运体基因转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究

目的 在体外细胞实验中证明转染人钠/碘同向转运体(hNIS)基因介导放射性碘治疗胶质瘤是有效的.方法 以脂质体转染法、用重组质粒将hNIS基因转染至人胶质瘤细胞株U251中.经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIS-U251),然后进行体外摄125I实验、NaClO4抑制实验、体外125I外流和内流实验,并绘制时间-放射性曲线.对经3700 MBq/L 131I处理的hNIS-U251细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTY)分析和流式细胞仪测定分析.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(LSD法).结果 hNIS-U251细胞株可以摄取碘,其摄碘能力较U251细胞提高117倍左右[2种细胞所摄取125I分别为(50 469.88±997.29)和(432.92±89.28)计数·min-1].经131I处理后,hNIS-U251细胞株的细胞增殖活性低于U251细胞株,两者S期细胞比率(SPF)差异有统计学意义(t=35.5,P＜0.001);增殖指数(PI)差异有统计学意义(t=6.33,P＜0.05).结论 131I可以被hNIS-U251细胞摄取,而且可以有效地杀伤胶质瘤细胞.     

smac基因的克隆及过表达对宫颈癌HeLa细胞γ射线敏感性的影响

目的 克隆smac（the second mitochondria-derived activator of caspases,smac）基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/smac,并转染宫颈癌HeLa细胞,探讨smac基因过表达对宫颈癌HeLa细胞γ射线敏感性的影响.方法 用RT-PCR的方法从HeLa细胞总RNA中克隆smac基因,连入pcDNA3.1载体并测序.将测序正确的pcDNA3.1/smac载体转染HeLa细胞系,利用RT-PCR法及Western blot鉴定HeLa细胞内smac基因的表达.γ射线照射后48 h利用MTT法检测各组细胞生长抑制率.结果 测序结果表明成功的从HeLa细胞总RNA中扩增了全长smac基因.RT-PCR及Western blot结果表明,转染pcDNA3.1/smac的HeLa/smac细胞中,smac基因表达量明显高于未转染的HeLa细胞及转染空载体pcDNA3.1的HeKa/pcDNA3.1细胞的表达量.不同剂量的γ射线照射48 h后,MTT结果表明,γ射线对转染pcDNA3.1/smac的HeLa/smac细胞的生长抑制率（38.85%）显著高于空白组HeLa细胞（17.64%）及转染空载体pcDNA3.1的HeLa/pcDNA3.1细胞（20.32%）.结论 成功地克隆了smac基因,在宫颈癌HeLa细胞中过表达外源smac基因能够提高其对γ射线的敏感性,有望开辟提高宫颈癌放疗敏感性的新途径.     

氟、钙、碘对大鼠甲状腺抗氧化能力的交互作用观察

目的 观察不同水平氟、钙、碘对甲状腺超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的交互作用.方法 应用2×2×2析因实验设计将80只Wistar大鼠分成8组,分别进行适中氟钙碘(NF,NCa,ND、适中氟碘高钙(NF,NI,HCa)、适中钙碘高氟(NCa,NI,HF)、适中碘高氟钙(NI,HF,HCa)、适中氟钙低碘(NF,NCa,LI)、适中氟高钙低碘(NF,HCa,LI)、适中钙高氟低碘(NCa,HF,LI)、高氟钙低碘(HF,HCa,LI)饲料喂养.适中氟为90μg/d,高氟较适中氟高30倍;适中钙为13mg/d,高钙较适中钙高20倍;适中碘为3.5μg/d,适中碘较低碘高15倍.6个月后分别采用黄嘌呤氧化酶法、可见光分光光度法和比色法测定各组动物甲状腺SOD和CAT的活性及MDA的含量.结果 氟与碘对甲状腺DOD活性存在交互作用(F=3.97,P=0.05),固定为NF和NCa时,LI组SOD活性高于NI组(t=2.36,P=0.03),固定为NF和HCa时,LI组SOD活性高于NI组(t=3.04,p=0.01),固定为HF和LI时,HCa组SOD活性低于NCa组(t=2.36,P=0.03),固定为NI和HCa时,HF组SOD活性高于NF组(t=-2.91,P=0.01).氟、钙与碘对CAT活性均存在交互作用(P＜0.01),固定为NF和NCa时,LI组CAT活性低于M组(t=3.27,P＜0.01),固定为NF和HCa时,u组CAT活性低于NI组(t=2.65,P=0.02),固定为HF和HCa时,LI组CAT活性高于NI组(t=-16.86,P＜0.01),固定为HF和LI时,Hca组CAT活性高于NCa组(t=-14.53,P＜0.01),固定为NI和HCa时,HF组CAT活性低于NF组(t=5.96,P＜0.01),固定为LI和HCa时,HF组CAT活性高于NF组(t=-10.05,P＜0.01).钙与碘对MDA存在交互作用(F=8.29,P=0.01),固定因素后两组间比较均无显著性差异(P＞0.05).其他各组间无差异.结论 氟、钙与碘对甲状腺SDD和CAT的作用不完全一致,且存在交互作用,但对MDA的作用影响甚微.     

pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒并建立人肺腺癌细胞株A549的稳定表达株.方法 采用RT-PCR法从正常人支气管上皮细胞株HBE135-E6E7中克隆得到PSMA7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接.双酶切和测序鉴定后,再将PSMA7片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上.构建好的pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,经脂质体转染法转入A549细胞株中,经CA18筛选,得到阳性克隆细胞株,再用RT-PCR及Westem blotting法检测转染后PS-MA7的mRNA及蛋白表达水平.结果 pcDNA3.1(-)/PSMA7质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实.目的 基因PSMA7的序列完全正确,真核表达质粒构建成功.RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的PSMA7 mRNA表达水平(2.698±0.661)明显高于未转染组(1.243±0.176)和转染pcDNA3.1(-)组(1.198±0.514,P<0.05),后两者间无明显差异.Western blotting检测同样显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的蛋白表达水平(1.978±0.661)明显高于未转染组(0.891±0.234)和转染pcDNA3.1(-)组(0.782±0.375,P<0.05),后两组间亦无明显差异.结论 成功构建了PSMA7基因的真核表达质粒,并建立了稳定表达PSMA7的A549细胞株,为后续研究奠定了基础.     

17-AAG对转染NIS基因的未分化甲状腺癌摄碘动力学的影响

目的 探讨17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)对已转染NIS基因的未分化甲状腺癌(ATC)细胞摄碘动力学的影响.方法 采用脂质体转染法,将携带NIS基因的重组质粒pcDNA3.1-NIS转染入ATC细胞株FRO细胞中,G418抗性筛选获得稳定表达细胞系NIS-FRO.在NIS-FRO细胞的培养基中引入125I,进行125I内流及外流的系列实验,绘制时间-放射性曲线.进一步分析经1μmol/L的17-AAG作用24 h后NIS-FRO细胞125I内流及外流的变化,并与未经转染的细胞进行对比,2组间各个时间点的放射性计数采用两样本t检验进行统计学分析.结果 NIS-FRO细胞的摄125I能力明显提高,约为FRO细胞的10.68倍(t=45.329,P＜0.001),但去除孵育环境中的125I后30 min,细胞内的125I滞留率仅为初始的10.5％.1μmol/L的17-AAG作用于NIS-FRO细胞后24h,细胞摄125I能力进一步提高,在含125I的培养基中孵育20～60 min,其放射性计数为31771.8～54815.5 min-1,摄125I能力较对照组( 24020.3～41293.8)提高了24.8％～ 35.5％(t值依次为3.096、4.275、3.055、4.292和5.496,P均＜0.05);撤掉孵育环境中的131I后5～30 min,细胞内的125I滞留率为32.7％ ～85.2％,较对照组(10.5％～56.8％)明显增加(t值依次为22.801、13.096、19.631、38.205、43.519和29.322,P均＜0.01),125I的外流减少,30 min后17-AAG作用组的细胞内125I滞留率为32.7％,为对照组的3.1倍.结论 把NIS转染入ATC细胞后获得的稳定表达细胞株在经一定浓度的17-AAG作用后,可进一步提高肿瘤细胞的摄碘率,并可明显延迟碘的外流,提高细胞内碘的滞留率.     

曲古菌素A对甲状腺癌细胞NIS基因表达和摄碘功能的影响

目的探讨曲古菌素A（TSA）对甲状腺癌细胞中钠／碘同向转运蛋白（NIS）基因表达和摄取碘的影响。方法以不同浓度的TSA诱导滤泡状甲状腺癌细胞FFC-133及乳头状甲状腺癌细胞K1,利用反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）分析经诱导后2株甲状腺癌细胞中NISmRNA的表达,以NIS／3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的条带密度比值作为mRNA表达强度,并检测诱导前后甲状腺癌细胞对放射性碘摄取的变化。2组数据间比较采用独立样本t检验,多组数据间比较用One．wayANONA方差分析。结果20,50,75,100和150nmol／LTSA诱导48h后,甲状腺癌细胞FFC-133的NISmRNA表达较未诱导对照组增加了1．5至13．7倍,各TSA浓度组间FTC-133NISmRNA表达差异有统计学意义（F=32．56,P〈0．01）;而K1的NISmRNA表达没有明显变化,TSA浓度为50和75nmol／L时表达有所增加（NIS／GAPDH条带密度比值分别为0．62±0．16,0．60±0．23）,但与对照组（O．41±0．18）比较差异无统计学意义（F=2．823,P〉0．05）。细胞摄取碘实验显示,50和75nmol／LTSA诱导48h后,FTC-133的摄碘增加[（15．42±0．42）×10’和（18．98±1．33）×10^3计数·min^-1／10^5个细胞],与对照组[（8．46±0．84）×10^3计数·min^-1／10%5个细胞]比较,差异有统计学意义（t值分别为3．018和3．557,P均〈0．05）;而50和75nmol／LTSA作用后K1对碘的摄取也有增加[（5．83±1．09）×10^3和（6．97±0．65）×10^3计数·min^-1／10^5个细胞],但与对照组[（5．37±0．88）×10^3计数·min^-1／10^5个细胞]比较,差异无统计学意义（t值分别为0．185和0．332,P均〉0．05）。结论TSA能明显诱导滤泡状甲状腺癌细胞的NISmRNA表达升高和摄碘增加,而对乳头状甲状腺癌细胞作用不明显。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法 将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段，按正向、反向克隆人真核表达载体pcDNA3．1（＋）。测序正确的重组子pcDNA3．1-a（含GCRG213正向克隆）、pcDNA3．1-b（含GCRG213反向克隆）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞，采用半定量RT-PCR及Western blot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞，采用细胞计数法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪分析细胞的增殖状态，Annexin VFITC／PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实，GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。与对应的空载体比较，转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35．4%，蛋白的表达上调49．4％，而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32．1％，蛋白的表达下调50．3％。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快，凋亡率下降，而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢，凋亡率增加。结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞凋亡，可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。     

IL-8基因真核表达载体的构建及其在OVCAR-3卵巢癌细胞中的表达

目的:构建白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)基因真核表达载体,瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞,为进一步探讨其与肿瘤发生发展关系奠定基础.方法:采用RT-PCR法自健康志愿者外周血单个核细胞扩增IL-8基因,构建pcDNA3.1( )/IL-8重组质粒;脂质体介导将外源基因转入OVCAR-3卵巢癌细胞,半定量RT-PCR、Western印迹及ELISA法鉴定其mRNA及蛋白瞬时表达后,MTT法检测细胞转染前后生长增殖特性的改变,FCM检测细胞周期的变化.结果:重组质粒双酶切电泳结果显示,相应位置(300 bp,5 400 bp)可见2条清晰特异的DNA条带;DNA测序结果进一步显示,重组质粒中插入的基因片段全长 300 bp,编码序列与GenBank报道的基因序列相符,阅读框保持不变;RT-PCR、Western 印迹检测及ELISA检测结果显示,转染后OVCAR-3细胞IL-8 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);MTT检测结果显示,IL-8转染细胞组转染3 d后的光密度值(D值)显著高于未转染细胞组(P<0.05);FCM分析结果显示,OVCAR-3细胞转染IL-8基因后进入S期的细胞比例显著增高,增殖指数也相应上升,与未转染及空质粒转染组细胞相比,差异显著(P<0.05).结论:IL-8基因真核表达载体成功构建并瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞;IL-8可以自分泌方式促进卵巢癌OVCAR-3细胞生长增殖.     

重组NIS基因腺病毒的制备及在心肌细胞中的特异表达

目的 构建肌凝蛋白轻链-2(MLC-2v)启动子调控的NIS腺病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性.方法 将MLC-2v启动子和NIS基因亚克隆至腺病毒穿梭载体,再与含有骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌(BJ5183)同源重组,经人胚肾细胞(HEK293)包装并扩增得到重组腺病毒Ad-MLC-NIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的腺病毒Ad-CMV-NIS、仅含有启动子的腺病毒Ad-MLC和仅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作为对照组.腺病毒体外感染心肌细胞和非心肌细胞,通过Western blot检测NIS蛋白的表达,行动态摄碘及NaClO4摄碘抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性.通过台盼蓝染色实验检测腺病毒感染及NIS摄碘情况对心肌细胞活力和增殖的影响.结果 成功构建重组NIS腺病毒.Western blot检测示感染Ad-CMV-NIS的心肌细胞和非心肌细胞均呈NIS蛋白高表达;感染Ad-MLC-NIS的非心肌细胞出现微量蛋白表达,而心肌细胞中NIS蛋白高表达.动态摄碘实验示感染Ad-MLC-NIS的H9C2细胞、A549细胞、U87细胞摄碘峰值分别为5844.0、833.6、846.0放射性计数·min-1.H9C2细胞的摄碘被NaClO4抑制.感染复数(MOI)为100的腺病毒感染心肌细胞,感染和摄碘实验对心肌细胞活力和增殖的影响较小.结论 MLC-2v启动子调控的腺病毒载体可使外源基因NIS在心肌细胞内特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS在心肌中作为报告基因的研究奠定了基础.     

hNIS基因转导黑色素瘤细胞介导125I摄取的实验研究

目的 探讨克隆的人钠／碘同向转运体(hNIS)基因cDNA的生物学性能及其用于黑色素瘤放射治疗的可能性。方法 用反转录—聚合酶链反应(RT—PCR)从人甲状腺组织总RNA中扩增出hNIS基因cDNA序列，将其克隆至pUCm—T载体并亚克隆至真核载体pcDNA3中，电击法将重组质粒导入黑色素瘤细胞(B16)建立新细胞系(B16-A)，在体外培养条件下研究其对放射性碘的摄取及外流情况。结果 成功克隆了hNIS基因，建立了能稳定表达hNIS基因的新型细胞系B16—A和单转空质粒pcDNA3的细胞系B16—B。B16—A细胞的摄碘能力较趴6细胞高17倍，较单转空质粒pcDNA3细胞系B16-B高19倍。碘的外流过程十分迅速，有效半衰期(T1/2)仅10min。结论 体外培养条件下，hNIS基因转导黑色素瘤细胞其本身足以介导碘的摄取，但有效半衰期较短，有待进一步研究如何增加放射性碘的摄取量及延长其细胞内滞留时间，从而提高放射生物学效应。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

HGF非融合蛋白真核表达载体的构建及其在骨骼肌细胞中的表达

目的构建以HGF为目的基因、以EGFP为报告基因的非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,并观察HGF基因在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中的表达。方法利用BamHI单酶切质粒pcDNA3-HGF,得到HGF基因片段,将其正向插入到真核表达载体pCMV-IRES-EGFP的CMV后方BamHI的单克隆位点。脂质体介导转染至原代培养的大鼠骨骼肌细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并用ELISA法检测HGF的表达情况。结果构建了HGF的非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞24~72h后,见30%的细胞表达EGFP。ELISA检测细胞培养液证实转染后第1天即有HGF的表达,第4天HGF浓度为(5402.0±227.9)ng/L。结论成功构建了非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,其在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中能有效表达。     

人类解旋酶样转录因子过表达促进辐射诱导的A549细胞凋亡

目的 探讨人类解旋酶样转录因子(HLTF)对辐射诱导细胞凋亡的影响及其机制。方法 将空质粒和带FLAG标签的HLTF表达质粒分别转染人肺癌细胞A549,⁶⁰Co γ射线照射观察细胞凋亡变化。用Western blot 检测HLTF在细胞核和胞质内水平的变化及线粒体细胞色素C的释放。结果 HLTF转染可促进γ射线诱导的细胞凋亡,凋亡率为(32.2±2.1)%,高于空载体转染组(11.4±2.3)%和Mock转染组(11.1±1.8)%(F=101.85,P<0.01)。辐射后HLTF在胞质内的表达水平显著提高。HLTF转染组胞质内细胞色素C的水平亦显著提高。结论 HLTF可促进辐射损伤诱导的细胞凋亡, 其部分机制可能是通过提高核质转位以及影响线粒体细胞色素C的释放来实现的。     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

人Slitrk1基因对PC12细胞增殖和分化的影响

目的研究人Slitrk1基因过表达对PC12细胞增殖和分化的影响。方法PCR扩增人Slitrk1 CDS，克隆到pcDNA4／myc-His A载体，构建重组质粒pcDNA4／St1，分别以空载体和重组质粒转染PC12细胞，RT-PCR法鉴定出阳性转染细胞，观察空载体转染的PC12细胞（pcDNA4／PC12）和过表达Slitrk1的PC12细胞（ST1／PC12）的表型并用MTT法检测细胞增殖情况。结果与空载体转染的PC12细胞相比，过表达Slitrk1基因的细胞增殖速度明显减慢。pcDNA4／PC12与野生型PC12细胞表型一致，均为悬浮成团生长，细胞少有突起，而ST1／PC12细胞大部分贴壁生长，突起多见，呈分化状态。结论过表达人Slitrk1基因能够抑制PC12细胞增殖，促进细胞的贴壁及突起长出。人Slitrk1基因可能有促进PC12细胞神经分化的作用。