大鼠脊髓神经元的原代无血清培养及鉴定

目的建立Wistar大鼠脊髓神经元的分离、无血清培养方法,为进行脊髓神经元的体外研究提供技术支持。方法分离14-17 d胎龄Wistar大鼠胎鼠的脊髓,经机械吹打,细胞计数后,接种于24孔板。每天在显微镜下进行神经元的形态观察。第7天用SABC免疫组化染色法检测神经元特异性烯醇化酶的表达。结果采用ITS无血清培养基,神经元生长良好,第7天神经元纯度达95%以上。结论机械分离无血清培养神经元的方法具有简便可行,结果稳定的优点,可作为神经元体外培养的良好模型,值得推广应用。     

皮质神经元B27原代培养及MAP2鉴定

目的对原代新生鼠皮质神经元原代培养方法进行改进,以获得纯度更高、体外更易存活的神经元进行相关实验研究。方法采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮质神经元悬液,进行培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)鉴定培养神经元的纯度。结果神经元细胞存活率高,在体外培养条件下细胞状态良好,生长旺盛。培养第4天,可见多数细胞长出1、2个突起并交织成网。培养第8天细胞胞体较大,能形成典型的神经细胞网络。培养第10天,鉴定神经元纯度质量分数达90%以上。结论该方法简便可行,是体外培养神经元较理想的方法。     

大鼠原代神经元的培养及操作技巧

目的:建立一种实用体外原代培养新生大鼠皮层神经元的方法.方法:取24h内的SD乳鼠两侧大脑皮层,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.利用免疫细胞化学进行鉴定.结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长;经神经元特异性鉴定,培养的神经元纯度可达90%以上.结论:该技术是一种可靠、稳定的获得神经元的方法,可以用于实验.     

木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取乳鼠原代皮层神经元及鉴定

目的 采用木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取24 h内新生SD大鼠皮层神经元,改进体外原代培养方法。方法取24 h内新生SD大鼠,剥离脑血管膜分离出大脑皮层,采用木瓜蛋白酶和DNA酶顺序消化、纯化后,以含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基为神经元接种液,4 h后更换为预热的含有B27的Neurobasal-A神经元培养液,连续培养7 d。分别以1×105、5×105、1×106细胞/mL接种于L-多聚赖氨酸浸泡后的6孔板内,并在显微镜下观察细胞的生长状态。取培养7 d后的神经元,采用β-Tubulin免疫荧光法和神经元特异性核蛋白（Neun）抗体免疫组化法鉴定神经元,神经元微管相关蛋白2抗体（MAP2）免疫荧光法鉴定神经元纯度。结果 神经元以密度为5×105细胞/mL接种最为合适,接种24 h后,皮层神经元部分贴壁;接种3 d后,贴壁细胞逐渐增多,神经元突触进一步生长并延长,交联成稀疏网络;接种7 d后,神经元仍大量生长,胞体丰满,并形成更为紧密的神经元网络系统。经β-Tubulin免疫荧光法和Neun抗体免疫组化法鉴定,提取培养细胞为神经元,并经神经元标志物MAP2免疫荧光法鉴定神经元...     

DP_2干预对铝负荷原代培养大鼠海马神经元的作用观察

目的建立麦芽酚铝致原代培养大鼠海马神经元损伤模型,探讨DP2干预对铝负荷原代海马神经元的作用。方法选取孕期18 d左右的SD大鼠,离体培养胎鼠海马神经元,d 7进行NSE免疫组化鉴定,并给予Al(malt)3建立铝负荷致原代培养大鼠海马神经元损伤模型,同时分别给予DP2激动剂DK-PGD2和DP2拮抗剂CAY10471进行干预。继续培养24 h后,检测各组海马神经元MTT值、LDH漏出率和Ca2+荧光强度,HE染色观察神经元病理形态变化。结果海马神经元纯度超过95%。与空白对照组比较,铝负荷模型组MTT值明显降低(P<0.01);LDH漏出率明显升高(P<0.01);Ca2+荧光强度明显增强(P<0.01);神经元细胞数目明显减少,突起萎缩甚至消失,部分细胞核固缩。与铝负荷模型组比较,DP2激动剂DK-PGD2干预组MTT值明显降低(P<0.01、P<0.05);LDH漏出率明显升高(P<0.01);Ca2+荧光强度有增强趋势,但差异无显著性;海马神经细胞几乎全部核固缩、裂解。DP2拮抗剂CAY10471干预组MTT值明显升高(P<0.01);LDH漏出率明显降低(P<0.01);Ca2+荧光强度明显减弱(P<0.01)。海马神经细胞胞体、胞核明显,裂解细胞明显减少。结论 DP2激活表达可增加神经元对铝盐损伤的易感性。     

大鼠睾丸间质祖细胞的原代培养及生长状况观察

目的建立一种睾丸间质祖细胞的纯化培养方法,为细胞移植治疗男性腺功能低下提供实验参考。方法分离、培养SD大鼠睾丸间质祖细胞（progenitor Leydig cell,PLC）,采用酶组织化学染色鉴定,HE染色及电镜技术观察形态,MTT、磁分离均相酶联免疫（磁酶免）睾酮定量测定法观察其体外生长分化情况。结果体外分离培养PLC,7d内生长状态良好,第4～6天时细胞增殖最快,第6天后,细胞纯度达90％以上。睾酮分泌量在培养24h最高,96h后明显下降,第5天后趋于平稳。结论经分离培养可获得纯度高、增值活性强的PLC。培养4～6d的细胞适于移植。     

毒胡萝卜素诱导大鼠皮层神经元内质网应激及丹红注射液的干预作用

目的：探讨毒胡萝卜紊诱导大鼠皮层神经元内质网应激凋亡的机制及丹红注射液的干预作用。方法：体外培养SD乳鼠皮层神经元，免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度。流式细胞术Annexin V、PI双标检测凋亡率及活性caspase-3、caspase-8、caspase-7、caspase-9表达，Western Noting免疫印迹分析caspase-12、GRP78、Bcl-2、细胞色素C蛋白表达，Fura-2／AM法荧光分光光度计检测细胞内钙浓度（[Ca^2＋]i）。结果：SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养。2μmol／L毒胡萝卜素作用神经元24、48h细胞凋亡率分别是17.88％、21.38％，丹红治疗组分别是6．30％、6．11％，两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。毒胡萝卜素诱导神经元GRP78表达上调，剪切活化caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-12，使细胞色素C表达增加，Bcl-2表达减少。丹红注射液促进细胞Bcl-2表达，抑制细胞色素C释放，减少活化的caspase-3、caspase-8、caspase-9含量，稳定游离钙浓度。结论：毒胡萝卜素诱导神经元内质网应激反应性凋亡。丹红注射液能抑制体外培养神经元内质网应激所致凋亡。     

大鼠胚胎小脑提取液对体外培养小脑神经细胞的作用

目的　观察不同胎龄大鼠小脑提取液 (cerebellum extracts,CE)对体外培养小脑神经细胞的影响。方法　制备不同蛋白浓度的 14、16、18、2 0 d胎鼠 (E14、E16、E18、E2 0 )及新生 1d鼠 (P1) CE,加入原代培养的E18胎鼠小脑神经细胞中 ,2 4h后以微量快速自动比色法检测细胞活性。结果　实验组各胎龄 CE均能促进培养小脑神经元的存活 ,并有蛋白浓度依赖关系 ,各胎龄都有各自不同的最适浓度 ,E16和 E18CE显示了更强的神经营养活性 ,与对照组及其他实验组相比差异有极显著性 (P<0 .0 0 1)。结论　 CE对培养小脑细胞具有高度神经营养活性。     

免疫磁珠法结合条件培养基进行低密度条件下的神经元原代培养

目的利用免疫磁珠(IMB)细胞分选技术结合星形胶质细胞条件培养基(A-CM)进行低密度条件下原代神经元培养。方法取新生(24 h)内昆明小鼠取大脑半球,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液进行原代培养。培养10 d后,利用恒温振荡法去除小胶质细胞等杂细胞,抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞纯度。利用达到纯度要求的细胞培养物制备A-CM。分别取新生(24 h)内昆明小鼠大脑皮质和海马,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液,经IMB细胞分选获得高纯度神经元,加入A-CM进行低密度条件下神经元的原代培养。观察培养过程中神经元的形态学指标,以抗160 ku神经丝抗体免疫荧光染色鉴定神经元纯度。结果细胞免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞的纯度>95%。小鼠皮质和海马神经元形态学观察与细胞免疫荧光染色结果表明,神经元在低密度培养条件下生长良好,不同发育阶段的形态学特征明显,纯度较高。结论低密度条件下成功培养了小鼠大脑皮质和海马原代神经元。     

一种改进的大脑皮层神经元原代培养方法的研究

目的:建立1种简单、高效的新生乳鼠大脑皮层神经元原代培养的方法。方法:出生12 h以内的SD乳鼠为研究对象,采用胰酶消化和机械分离法相结合制备细胞悬液;在细胞培养过程中,不加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞生长,而是用2%B27 Neurobasal A medium维持培养。结果:神经元生长良好,形成神经元网络系统;通过神经元免疫组织化学鉴定神经元纯度达90%以上。结论:此方法是获得纯度较高的神经元的1种可靠方法。     

SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元的原代培养

目的建立用自制的鼠尾胶原联合胰酶消化法原代培养SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元。方法采用出生3 d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,通过胰酶消化后在自制鼠尾胶原包被的培养皿中进行原代培养,应用神经微丝蛋白进行免疫组化鉴定。结果获得的螺旋神经元细胞在体外能较快地贴壁,可以存活、生长,细胞形态良好。结论自制鼠尾胶原联合胰酶消化的培养方法可获得良好状态的螺旋神经元细胞,为原代培养螺旋神经元提供了新思路。     

大鼠海马神经元癫痫样放电模型的构建

目的探讨“无镁细胞外液”诱导体外培养大鼠海马神经元产生癫痫样放电的可行性,以期建立难治性癫痫离体细胞模型。方法选取24h内新生Wistar大鼠,分离海马神经元后进行原代培养,体外培养至第12天时,用“无镁细胞外液”处理3h,应用全细胞膜片钳技术记录海马神经元的放电情况。结果在培养第12天时,神经元突起间彼此接触形成神经网络。在“无镁细胞外液”处理3h后神经元产生稳定的放电,恢复正常细胞培养液培养24h,神经元仍可检测到自发的“癫痫样放电”。结论体外培养第12天海马神经元,在“无钱细胞外液”处理后可形成稳定的自发性癫痫样放电,为今后在细胞分子水平研究癫痫发病机制提供了一种理想模型。     

缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元凋亡和一氧化氮合酶表达变化及银杏叶提取物的作用

目的:观察银杏叶提取物(EGb)及其活性成份银杏总内酯(Gin)对缺氧再复氧诱导的大鼠海马神经元凋亡及一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)表达影响。方法:选用胎龄15d的SD胎鼠的大脑海马细胞进行原代培养,建立缺氧再复氧海马神经元损伤模型。实验分以下几组:正常组、缺氧复氧组、EGb组、Gin组、阳性对照组(MK801组)。应用TUNEL原位末端标记法定量分析细胞凋亡以及NADPHd组织化学染色法观察细胞NOS的表达。结果:(1)TUNEL免疫细胞化学染色结果显示,预先加入EGb和Gin的药物组神经元的凋亡率明显低于缺氧复氧组;(2)NADPHd组织化学染色结果显示,预先加入EGb和Gin的药物组抑制神经元NOS表达,NADPH阳性细胞减少。结论:EGb及其活性成份Gin对缺氧再复氧损伤的海马神经元具有保护作用,可部分拮抗缺氧再复氧条件下体外培养的海马神经元的凋亡,抑制NOS的表达。     

新生大鼠海马和皮层神经元的原代培养及鉴定

目的建立一种条件简单易存活,适用于生理、药理学研究的原代神经元培养方法。方法应用新生(48 h以内)大鼠采用急性分离、胰酶消化的方法培养海马和皮层神经细胞,并结合膜片钳及RT-PCR技术鉴定所培养的神经元电压依赖性离子通道的表达情况。结果体外培养的神经细胞生长状态良好,免疫荧光染色鉴定结果表明该方法培养的神经元纯度可达90%以上;全细胞电压依赖性离子通道表达情况良好。结论应用该方法培养神经细胞操作简单并保持了良好的生理特性,可用于神经元生理特性考察及药理实验研究,是体外培养神经元较理想的方法。     

胎鼠脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 研究胎鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法 从孕15d胎鼠的大脑皮层和海马区脑组织中获取NSCs,在含有B27、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的DMEM/F12无血清培养液中培养;传代后用5%胎牛血清培养液诱导NSCs分化。结果 体外分离培养的NSCs在无血清培养液中形成大量的神经球。经3-5代传代的细胞生长稳定。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞,神经细胞球经胎牛血清培养液贴壁培养后可分化为神经元特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂表达阳性的细胞。结论 从孕15d胎鼠大脑皮质和海马组织分离出的NSCs具有自我更新能力和多向分化潜能,其在5%胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

胎鼠多巴胺能神经元前体细胞体外扩增和诱导分化的初步研究

目的　尝试体外扩增胎鼠多巴胺能神经元前体细胞并用L 抗坏血酸 2 磷酸酯倍半镁盐 (AA 2P)促其分化成多巴胺能神经元。方法　体外培养来自胎鼠中脑腹侧组织的前体细胞 ,用bFGF促其增殖 7天 ,而后用AA 2P促其分化 ,并进行免疫荧光染色分析。结果　细胞总数平均增长了 6 8倍 ,其中星形胶质细胞只占 ( 4 15± 1 37) % ,而神经元占 ( 2 0 38± 11 6 0 ) % ,多巴胺能神经元占所有神经元的 ( 2 9 4 7± 13 79) %。结论　该方法能体外扩增胎鼠多巴胺能神经元前体细胞并促其分化为多巴胺能神经元     

鼠结肠平滑肌细胞的分离、培养与鉴定

目的建立体外培养鼠结肠平滑肌细胞的方法。方法应用酶解法分离大鼠的结肠平滑肌细胞,用含10％胎牛血清的DMEM液进行鼠结肠平滑肌细胞的原代培养及传代,并以免疫细胞化学对其进行鉴定。结果新鲜分离的结肠平滑肌细胞呈梭形,核居中。培养24h后细胞开始贴壁,3～5d后开始增殖,14d后细胞密集,呈峰谷样生长。细胞经平滑肌特异性肌动蛋白a-actin鉴定,确定为平滑肌细胞。结论应用酶解法可得到急性分离的鼠结肠平滑肌细胞,用含10％胎牛血清的DMEM液重悬分离得到的结肠平滑肌细胞,经过10d左右的培养可以获得结肠平滑肌细胞。该方法重复性好,效果稳定。     

激活小胶质细胞α_7-nAChR减少Aβ蛋白所致的神经元毒性的研究

目的研究激活小胶质细胞上的α7-烟碱型乙酰胆碱受体对减少由于β-淀粉样蛋白1-42沉积所致的慢性炎性反应对神经元毒性作用。方法取孕18 d的胎鼠大脑皮质做原代神经元的培养,选用微管相关蛋白-2与神经元特异性烯醇化酶作为神经元特异性标志物,用免疫细胞化学技术对神经元进行鉴定。培养10 d的神经元与小胶质细胞共同培养于带有膜插件的培养皿中。试验分空白对照组、β-淀粉样蛋白组、共培养组、烟碱预处理组,各组添加β-淀粉样蛋白1-42共培养96 h后,用流式细胞仪及免疫荧光法检测神经元的凋亡率。结果体外培养10 d的神经元,用免疫荧光及DAB显色鉴定神经元均能显色,细胞纯度达到了94.49%。激活组与未激活组相比神经元的凋亡率明显下降(P<0.05)。结论激活小胶质细胞上的α7-烟碱型乙酰胆碱受体能减少β-淀粉样蛋白介导的神经元凋亡,对神经元产生保护作用。     

大脑皮层神经元原代培养方法的改良及一种体外缺氧缺糖简易模型的建立

目的改进SD胎鼠大脑皮层神经元体外原代培养方法及其一种缺氧缺糖(OGD)简易模型建立。方法用温和的TrypLE胰酶消化得到单个皮层神经细胞,用含有B27的Neurobasol培养基进行培养。培养7 d后,将其培养液换成无糖DMEM培养液,放入缺氧装置中分别培养4、5及6 h,利用MTT法检测细胞存活率,并用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH的释放量。结果分离和培养的神经元生长状态良好,免疫荧光方法证明该方法培养的大脑皮层神经元纯度可达到(93.2±1.3)%,能够达到实验研究的要求。细胞OGD 4、5及6 h后,细胞存活率分别为(52.7±1.3)%、(26.5±3.3)%及(20.8±1.1)%;LDH的释放量分别为(52.9±4.8)%、(89.3±1.3)%及(93.2±1.1)%。结论改良后的培养方法能够稳定地获得高纯度的SD胎鼠大脑皮层神经元,用厌氧发生装置替代三气培养箱建立了一种OGD简易模型,同时选择OGD 4 h作为缺氧缺糖模型最佳时间点。