HIV-1 Vpr蛋白对C8166细胞毒性研究

目的 利用腺病毒系统研究HIV-1 Vpr蛋白在T细胞来源的C8166细胞内的高表达以及细胞内该蛋白对T细胞毒性.方法 将表达目的 蛋白Vpr的重组腺病毒rAd-vpr和空白载体病毒rAd-vector分别感染对数生长期的C8166细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布、凋亡和坏死.用Hoechst-PI荧光染色观察细胞的凋亡和坏死,JC-1荧光染色测定线粒体膜电势.结果 Annexin V-PI染色及Hoechst-PI染色一致显示HIV-1 Vpr能显著诱导C8166细胞凋亡和坏死;PI细胞周期结果表明HIV-1 Vpr能阻滞C8166细胞于G2期;JC-1荧光染色法测定HIV-1 Vpr致C8166线粒体膜电势下降.结论 细胞内HIV-1 Vpr介导的T细胞毒性包括线粒体功能障碍、细胞周期的G2期阻滞和细胞的死亡.     

HIV-1 Vpr对细胞周期的影响和致凋亡作用的研究

目的 研究人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的vpr基因和不同变异株对宿主细胞周期和凋亡的影响,以及其致细胞周期变化和致细胞凋亡机制的两者间的可能关系.方法 将14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 upr片段分别连入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒.将这些重组质粒电转染Jurkat细胞,并设立保守株vpr基因转染细胞、突变株vpr-Fs基因转染细胞、空载体转染细胞和未转染细胞作为对照.经G418选择培养及RT-PCR检测目的基因转染成功后,PI染色,流式细胞仪检测被转染细胞的细胞周期分布和细胞凋亡.结果 流式细胞仪检测上述14个带有不同变异位点的HIV-1 vpr基因片段的Jurkat细胞,发现转染保守片段HIV-1 vpr的Jurkat细胞,其细胞周期出现G_2期阻滞和细胞凋亡率明显升高,但转染vpr C端截断的vpr-Fs片段的细胞、空载体peDNA3.1(+)转染细胞和未转染的Jurkat细胞无此现象.转染了,HIV-1 vpr基因序列相对应的Vpr蛋白中含有70V、85P、86G、94G突变的片段,较vpr保守片段其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力明显下降,且Vpr蛋白的AE亚型致细胞周期阻滞和致凋亡能力较其他亚型普遍为低.初步发现vpr诱导G2期阻滞百分比越高其所致凋亡率越高.结论 HIV-I vpr基因有明显的致感染细胞G_2周期阻滞和致细胞凋亡的作用,但vpr C端截断的vpr-Fs片段无此功能.首次发现中国感染者HIV-1 vpr基因表达蛋白的70V、85P、86G、94G位点突变能使其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力下降,Vpr的AE亚型致细胞周期阻滞和凋亡能力较其他亚型普遍为低.对14个变异片段的分析显示vpr诱导G_2期阻滞的程度与其致凋亡水平可能相关,提示两者的发生机制可能有一定的关联.本研究为进一步探讨HIV-1致病机制和探索可能的基因干预措施打下基础.     

重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白R(Vpr)的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR(RT-PCR)检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹(Western blot)技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子(Rta)mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.     

表达HIV Vpr细胞株的建立及其促细胞凋亡作用的研究

目的 建立稳定表达人免疫缺陷病毒(HIV)Vpr蛋白的细胞株,观察Vpr蛋白促进感染细胞凋亡的特性,以及Vpr变异后对其致凋亡作用的影响.方法 以携带野生株HIV Vpr基因和突变株HIV vpr-FS基因的质粒分别转染HeLa细胞,建立稳定表达HIV Vpr蛋白的细胞株,以流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法检测细胞凋亡效果,观察Vpr蛋白促细胞凋亡的特性,以及两者致凋亡作用的区别.结果 重组质粒pcDNA3.1-vpr和pcDNA3.1-vpr-FS经酶切后均可获得342bp产物,DNA测序结果与目的 基因已知序列完全一致;上述质粒转染的HeLa细胞,RT-PCR检测到目的 基因vpr或vpr-FS的表达,Western blot检测到明显Vpr或Vpr-FS蛋白的表达.流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法分别检测细胞凋亡,显示野生株HeLa pcDNA3.1-vpr组的凋亡率明显高于对照组,而变异株HeLa pcDNA3.1-vpr-FS的凋亡率与对照组无明显差别.结论 成功建立了表达HIV Vpr和HIVVpr-FS蛋白的感染细胞株.实验显示HIV Vpr蛋白能促进感染细胞的凋亡,而Vpr蛋白的变异可能使其促进细胞凋亡作用减弱.实验结果为下一步研究提供了基础资料.     

siArid2重组腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

 目的:通过RNA干扰技术沉默内源性抑癌基因Arid2(siArid2)的表达,观察其对肝癌细胞生长及细胞周期的影响。方法: 设计3对特异性沉默Arid2基因的shRNA序列,分别克隆到腺病毒骨架载体上形成重组腺病毒质粒。将质粒转染到HEK293细胞中,包装和扩增形成完整高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。用构建好的腺病毒感染人肝癌SMMC-7721细胞,Western blotting方法检测Arid2蛋白的表达,筛选干扰效果最佳的重组腺病毒。MTS技术和流式细胞术观察干扰Arid2基因后肝癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果: 成功构建了高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。经Western blotting鉴定,AdsiArid2-3为抑制效果最佳的重组腺病毒。MTS结果显示,AdsiArid2组细胞在72 h、96 h的吸光度值与空细胞组和Adsicontrol组相比增高,细胞增殖速率明显加快。流式细胞术检测结果显示,AdsiArid2组处于G1期、S期的细胞百分比与空细胞组和Adsicontrol组相比,G1期细胞百分比明显减少,S期细胞百分比明显增多。结论: 成功构建干扰Arid2的重组质粒及重组腺病毒。沉默Arid2可以促进肝癌细胞的增殖,促进其由G1期向S期的转换。     

大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因（GLUT1）的复制缺陷型重组腺病毒载体，为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-Glut1，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-Glut1，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印迹法（Western blotting）从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd-Glut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及Western blotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的 构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5α;筛选出重组质粒pAdTrack-CMV- HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pAd-HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad-HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT-PCR、Western 印迹鉴定外源基因HAX1的表达.BrdU检测感染了Ad-HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况.结果 pAdTrack-CMV-HAX1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-HAX1 质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符.构建好的Ad-HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达.HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高.结论 成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖.     

HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的 构建含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白.方法 PCR扩增,获得HIV-1 C亚型gp120片段,定向克隆入腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd-gp120,PacⅠ酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd-gp120.结果 经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd-gp120重组腺病毒;通过Western 印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120 kD的蛋白.结论 成功构建了含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达.     

丙型肝炎病毒核心基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

目的构建HCV C基因重组腺病毒，以期用于HCV C蛋白的功能研究。方法以含有丙肝病毒1b亚型核心基因的质粒pcDNA3.1／HCV-C为模板，PCR扩增HCV C基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd-C，PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad-C，继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测HCV C蛋白的表达。结果PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒Ad-C构建成功。结论成功构建了重组腺病毒Ad-C，为进一步研究核心蛋白的生物学功能奠定了基础。     

表达HIV-1 gag-pol△和gp 140 TM蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及免疫效果研究

目的构建表达人免疫缺陷病毒Ⅰ型gag-pol△和gp140TM基因的非复制型重组腺病毒.方法首先将HIV-1的gag-pol△和gp140TM基因插入穿梭载体,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183,获得重组子.转化293细胞后获得重组病毒.重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中的抗体.结果获得两株重组腺病毒vAd-gag-pol△和vAd-gp140TM,能正确表达Gp140TM、Gag蛋白以及经剪切加工的P24蛋白,与DNA疫苗联合免疫小鼠后能产生高滴度的HIV-1特异性的抗体.结论成功构建了表达HIV-1结构基因的重组腺病毒,能有效诱导HIV-1特异性抗体.     

重组hFGF-10腺病毒促进角质形成细胞增殖

目的： 构建重组人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）腺病毒，并观察其对角质形成细胞增殖的影响，为探索新的皮肤组织工程种子细胞的来源奠定基础。方法: 用PCR方法扩增得到人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）基因片段，与穿梭载体pAdTrack-CMV连接，获得的重组质粒pAdTrack-CMV-hFGF-10经Pme I线性化后，通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-hFGF-10，经酶切鉴定后转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中包装并扩增腺病毒。用重组腺病毒感染HaCat细胞，Western blotting检测培养上清中的重组hFGF-10。MTT法检测重组腺病毒对角质形成细胞增殖的影响。结果: 成功构建了含hFGF-10基因的重组腺病毒，可高效感染HaCat细胞，培养上清与hFGF-10抗体呈阳性反应。重组腺病毒对角质形成细胞的增殖具有促进作用。结论: 制备出的重组腺病毒感染HaCat细胞后分泌表达hFGF-10，并可促进HaCat细胞的增殖。     

人微小RNA-16（miR-16）重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备人微小RNA-16（miR-16）重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞（hMSCs）中的表达及对细胞周期素依赖蛋白激酶6（CDK6）表达的影响。方法从人基因组DNA中扩增miR-16前体的DNA,定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经PmeⅠ线性化的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-16与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,在细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒rAdTrack-miR-16。将经PacⅠ线性化的rAdTrack-miR-16在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-16的重组腺病毒rAd-miR-16。将重组腺病毒感染hMSCs,分别检测miR-16前体和miR-16靶基因CDK6的表达。结果 pAdTrack-CMV-miR-16构建正确,在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-16。rAd-miR-16感染的hMSCs中miR-16前体水平显著升高（P〈0.05）,CDK6mRNA的表达降低不明显,CDK6蛋白表达水平显著降低（P〈0.01）。结论成功制备了表达人miR-16的重组腺病毒,并能有效介导miR-16在hMSCs中的表达,为进行miR-16的功能研究创造了条件。     

表达人B7-1的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的构建表达B7-1基因的重组腺病毒载体,制备相应的复制缺陷型重组腺病毒并检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建携带人B7-1基因的重组穿梭载体pAdtrack-B7-1,PmeI线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-B7-1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株,RT-PCR检测感染细胞中B7-1基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrackB7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。制备的Ad-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6d高水平的B7-1的表达,整体表达可持续两周。结论成功构建了同时表达B7-1的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的B7-1基因,为进一步研究B7-1的功能及应用B7-1进行基因治疗奠定基础。     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

Flag与GFP双标记人微粒体甘油三酯转移蛋白重组腺病毒载体的构建与表达

目的利用重组腺病毒（adenovirus，ad）技术Adeasy系统构建带绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）和Flag双标记的人类微粒体甘油三酯转移蛋白（human microsomal triglyceride transfer protein，hMTP）基因重组腺病毒载体，并包装成高滴度的腺病毒。方法自人HepG2细胞获得RNA，以RT-PCR和Nested PCR扩增hMTP-flag基因。PCR产物经测序证实后插入穿梭质粒GFP-Track。经PmeⅠ酶切线性化后，共转化到含腺病毒骨架质粒Adeasy的感受态细菌BJ5183。筛取阳性克隆，经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞，产生包装病毒颗粒，并传代扩增培养。结果经测序证实得到hMTP-flag-GFP基因，限制性内切酶证实同源重组腺病毒包含目的基因。荧光显微镜下可见GFP的高效表达，Western-blot检测可见97KD目的条带（hMTP分子质量为97KD）。结论成功构建含hMTP-flag-GFP基因的双标记重组腺病毒载体，并进行蛋白质表达，为进一步研究脂蛋白的功能打好了坚实基础。     

草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:探索制备免疫不育疫苗的新途径,获得草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)重组腺病毒减毒活疫苗。方法:将LZP3基因亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带LZP3基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装成病毒颗粒。PCR鉴定重组腺病毒,继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞,并以RT-PCR、Western blot检测LZP3的转录和表达。结果:成功构建了携带LZP3基因的重组腺病毒pAd-LZP3载体,其转染293细胞后包装出重组病毒,PCR证实LZP3基因已整合至腺病毒基因组中,病毒的滴度可达1.2×1010pfu/L。RT-PCR和Western blot检测表明RAd-LZP3感染的HeLa细胞中LZP3基因能够有效转录和表达。结论:制备的RAd-LZP3可成功表达LZP3基因,为后续开展RAd-LZP3免疫动物的研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因重组腺病毒的构建及在HepG2细胞中的表达

从携带有双拷贝乙肝病毒adw亚型全基因组的质粒pecob6获得X基因片段,将其亚克隆到AdEasy腺病毒系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-X,PacI酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad-X,Ad-X可感染HepG2细胞,Western-blot法检测到X蛋白的表达,重组腺病毒Ad-X构建成功,为进一步研究X蛋白的生物学功能奠定了基础。     

共表达人B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的构建能同时表达B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒载体，同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒，检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建以串联方式携带人B7-1和HGF／NK4基因的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1。Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd—NK4-B7—1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒，应用病毒悬液感染人喉癌细胞株。用RT-PCR检测感染细胞中B7-1和NK4基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrack—NK4-B7—1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF／NK4，同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达并逐渐增多、增强。制备的Ad—NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞，感染后可维持6d高水平的B7—1和NK4基因的表达，整体表达可持续2周。结论成功构建了同时表达B7．1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒，该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因，为进一步研究B7—1和NK4基因的功能及应用B7—1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材。