人肠道病毒71型VP1和VP4的抗原融合表达及鉴定

目的:构建人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)VP1-VP4重组融合蛋白表达体系.方法:构建EV71 VP1-VP4重组融合蛋白原核表达载体转化大肠杆菌DH5α,诱导表达融合蛋白VP1-VP4,SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定.用融和蛋白包被ELISA板检测41例已知血清.结果:重组片段VP1-VP4测序结果与设计目的片段序列相符,重组载体构建成功;SDS-PAGE显示融合蛋白约42.8kDa,与预期值一致;Westernblot提示该融合蛋白可以和EV71 VP1、VP4抗体特异性结合.融合蛋白包被ELISA板能准确检测出41例血清中16例EV71阳性血清,与CA16无交叉反应.结论:表达的EV71 VP1-VP4融合蛋白具有良好的抗原性,可作为EV71感染检测抗原,为EV71诊断试剂和疫苗的研究奠定实验基础.     

风疹病毒包膜糖蛋白E1的原核表达及条件优化

目的 为风疹病毒（RV）感染提供特异性及敏感性高的检测手段。方法采用PCR扩增RV包膜糖蛋白E1基因202—353aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,构建pET30a（＋）-E1,转化BL21（plysS）菌株,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;并探讨温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间对目的蛋白表达产量的影响。结果获得相对分子质量约为16．6kD的融合蛋白,Western Blot证明其具有良好的抗原性,并确定该蛋白在30℃、0．6mmol／L IPTG的条件下诱导表达4h可获得最佳表达量。结论本研究为RV包膜糖蛋白E1抗原纯化及应用奠定了基础,亦为研制生产高特异性和敏感性的RV检测试剂盒提供了实验依据。     

肠道病毒71型VP1包涵体蛋白的复性与纯化

目的 利用原核表达系统,经优化诱导条件及变、复性将包涵体形式肠道病毒71型结构蛋白VP1进行纯化。方法 通过RT-PCR扩增VP1基因,并应用基因克隆技术将VP1基因与pET-28a原核表达载体连接,之后将重组载体转化至大肠埃希菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后对包涵体进行变、复性,采用His镍柱亲和层析对VP1蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE和Western blot对VP1蛋白进行分析鉴定。结果 PCR扩增出891 bp的EV71-VP1基因,双酶切鉴定原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1构建正确。重组载体转化DE3后经IPTG诱导表达VP1蛋白,且以包涵体形式存在。将包涵体变、复性,经SDS-PAGE分离后进行镍柱纯化,得到较纯的目的蛋白,Western blot分析该蛋白能被相应抗体识别。结论 构建的原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1转化DE3后经IPTG诱导表达以包涵体形式存在的VP1蛋白,复性后纯化的VP1蛋白具有免疫原性,为EV71 VP1蛋白的研究与开发奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1外壳蛋白二级结构及B细胞表位预测

目的预测肠道病毒71型（EV71）外壳蛋白VP1二级结构和B细胞表位,为制备EV71疫苗的研究提供理论基础。方法应用GOR4、HNN、SOPMA、nnPredict等方法预测EV71 VP1二级结构,并结合亲水性、柔韧性、表面可能性和吴氏抗原指数法综合预测潜在的B细胞表位。结果EV71 VP1二级结构以无规卷曲和β-片层为主,含有少量的α-螺旋,少见β-转角;EV71 VP1潜在的B细胞表位很可能位于第67-71位氨基酸残基。结论联合多种生物信息学方法成功预测了EV71 VP1二级结构和B细胞表位;此为制备EV71疫苗的研究提供了理论基础。     

基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）的制备及鉴定

目的　对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）进行原核表达并初步鉴定。方法　利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过EcoR I和Sal Ⅰ双酶切构建pET30a⁃EgG1Y162⁃2（4）重组质粒,将重组质粒转化入感受态细胞,利用异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃β⁃D⁃thiogalactoside, IPTG）诱导蛋白表达, Western blotting鉴定原核表达蛋白产物,并应用细粒棘球蚴病患者及健康人血清分析重组蛋白抗原性。 结果　构建的重组疫苗EgG1Y162⁃2（4）三维结构串联的4个EgG1Y162⁃2蛋白均能独立、有效表达且具有良好抗原性。重组质粒pET30a⁃EgG1Y162⁃2（4）在0.2 mmol/L IPTG 37 ℃诱导4 h条件下,上清中目的蛋白表达量最高,使用60 mmol/L咪唑洗脱的蛋白成分较纯。Western blotting分析发现,重组多表位蛋白HIS⁃EgG1Y162⁃2（4）在约39 kDa位置处出现条带,且该蛋白可被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论　成功构建了细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162⁃2（4）,为研究细粒棘球蚴病重组多表位疫苗奠定了基础。     

EV71 VP1黏膜疫苗制备及其诱导黏膜免疫的实验研究

摘要：目的研究表面展示肠道病毒71型（EV71）结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢制备疫苗的可行性及应用价值。方法以表面展示EV71 VP1蛋白的重组枯草芽孢杆菌及野生型同基因株枯草芽孢杆菌制备疫苗,并分别通过灌胃＋滴鼻途径免疫BALB／c小鼠（观察组和对照组各16只）,4周后摘眼球取血,脱臼处死小鼠收集肺泡及小肠冲洗液,采用ELISA方法检测血清、肺黏膜、肠黏膜中VP1特异性IgA抗体水平。结果枯草芽孢杆菌经培养及溶菌酶处理后均以芽孢形式存在;观察组血清及肺黏膜中VP1特异性IgA抗体水平均显著高于对照组（P均〈0．01）,但两组肠黏膜中抗体水平无显著差异。结论展示EV71结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢可成功制备疫苗,且能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应;此为EV71疫苗的研制提供了新思路。     

双歧杆菌肠道内调控表达肠道病毒71型VP1蛋白的实验研究

目的构建重组肠道病毒71VP1基因双歧杆菌,制成口服疫苗,用于EV71感染预防。方法扩增EV71病毒VP1基因并将其插入到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBBAD/Xs中,构建VP1表达载体(pBBADs-VP1),通过Western blot检测VP1蛋白在pBBADs-VP1转化菌中的表达。选取BALB/c小鼠,分为B-VP1组、VP1组、GFP组和生理盐水组,B-VP1组口服pBBADs-VP1-转化双岐杆菌,VP1组腹腔注射大肠埃希菌表达纯化的重组VP1蛋白,GFP组口服pBBADs-GFP转化双岐杆菌,生理盐水组口服生理盐水,观察pBBADs-VP1-转化双岐杆菌口服免疫对EV71感染的免疫反应:包括病毒的中和抗体滴度、抗EV71-VP1抗体以及诱导脾脏和淋巴集结中Th1免疫反应。结果与GFP组及生理盐水组比较,B-VP1组及VP1组中和抗体滴度及抗EV71-VP1抗体水平,均显著增加;口服表达VP1蛋白长双歧杆菌和注射VP1蛋白都会诱导Th1细胞因子免疫反应(P<0.05),表达VP1蛋白长双歧杆菌较易诱导局部肠道的Th1模式,而注射VP1蛋白较易诱导全身性免疫。攻毒试验显示,VPI和B-VP1组新生鼠攻击后第15d(剂量1 000LD50)存活率分别为20.00%和16.67%,对照组无小鼠存活。结论利用长双歧杆菌表达VP1蛋白的口服疫苗可能成功激发针对EV71病毒感染的特异性免疫应答。用表达VP1的重组双歧杆菌免疫母鼠,可以赋予新生小鼠以保护。     

肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞表位的预测

目的预测C4基因亚型肠道病毒71型的VP1蛋白二级结构及B细胞表位,为EV71疫苗研制提供理论基础。方法本研究将宁波地区EV71分离株与国内外EV71代表株进行同源性分析和并构建亲缘进化树。以VP1基因序列为材料,应用EX-PASY服务器上的GOR4、SOPMA两种方法分析预测蛋白质二级结构,并结合蛋白质的亲水性、柔韧性、表面可能性等指标综合评价VP1蛋白的B细胞抗原表位。结果同源性分析和亲缘进化分析得出,2010年宁波EV71分离株属于C4a基因亚型,与基因库检索到的C4a基因亚型代表株核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为93.6%～99.3%和98.3%～100%。VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,有多处抗原指数较高的区段,结合亲水性、柔韧性、表面可能性等指标,综合预测VP1蛋白的B细胞抗原表位在第39～40、159～167、212～220、287～290位氨基酸残基的可能性较大。结论 EV71VP1蛋白多个区段具有抗原潜力通过生物信息学方法预测VP1蛋白二级结构及B细胞表位为EV71疫苗研制提供理论基础。     

幽门螺杆菌CagV蛋白的克隆表达及初步分析

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacte rpylori）IV型分泌系统cagV（hp0530）基因的原核表达系统,表达并纯化CagV蛋白,初步分析其结构和抗原性,为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和治疗药物的筛选奠定基础。方法以H．Py—loriATCC700392株基因组为模板,采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的片段,将其插入表达载体pET28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）,表达纯化后利用蛋白质印迹（Westernblot）分析CagV蛋白的抗原性。结果双酶切鉴定结果证实cagV基因重组表达载体构建成功;重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为幽门螺杆菌CagV蛋白;Westernblot检测结果显示CagV蛋白具有特异抗原性。结论所克隆表达的CagV蛋白具有较好的抗原性,对后续的的H．pylori致病性和检测、分析研究有比较重要的意义。     

幽门螺杆菌融合蛋白HCTV的表达及免疫原性研究

目的构建表达幽门螺杆菌融合蛋白粘附素-细胞空泡毒素A-霍乱毒素B亚单位(HpaA-CtxB-VacA,HCTV)的原核表达载体,并诱导表达,为制备具有治疗与预防作用的多联疫苗奠定基础。方法用PCR技术从pQE-hctB扩增hpaA和ctxB目的基因片段,从pQE30-V质粒扩增出vacA基因,同时插入表达载体pQE-30,构建成pQE-hctv。再将pQE-hctv转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果。Western blotting鉴定其抗原性。结果融合蛋白的相对分子量约为68000,可溶性表达占全菌的15%以上,经亲和层析后可获得纯度为90%以上的重组蛋白。Western blotting分析其能分别与HpaA抗血清、VacA抗血清和CT抗血清特异性反应。结论重组表达质粒pQE30-hctv表达成功,而且具有各自蛋白的抗原性,为进一步研究融和蛋白的功能和制备集预防和治疗为一体的Hp候选口服疫苗提供基础。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因，并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后，经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得重组Rv3873蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

空肠弯曲菌CadF蛋白的原核表达与产物分析

目的构建空肠弯曲菌cadF基因重组表达质粒pET30a(+)-cadF,分析其在大肠埃希菌中的表达情况及其融合蛋白的抗原性。方法用PCR方法扩增cadF基因,构建重组克隆质粒和表达质粒,经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后在E.coli(DE3)原核表达系统中诱导表达,SDS-PAGE和飞行时间质谱鉴定表达蛋白,Western blot分析其抗原性。结果含重组表达载体pET-30a(+)-cadF中的cadF基因序列经测序证实与出发菌株cadF基因序列100%同源,并成功诱导表达CadF蛋白,Westernblot显示该CadF融合蛋白能被抗空肠弯曲菌多克隆兔血清识别。结论成功构建了空肠弯曲菌cadF基因重组表达载体,表达产物具有抗原性。     

布鲁氏菌BP26蛋白的表达纯化及其抗原性的研究

目的获得布鲁氏菌感染血清学诊断优势抗原BP26重组蛋白。方法应用PCR技术从布鲁氏菌减毒株(104M)中扩增出bp26目的基因片段,将其克隆于表达载体PET30a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,用亲和层析纯化BP26重组蛋白,然后分别用Western-blot,间接ELISA检测其抗原性。结果DNA测序及酶切鉴定证实PET-30a/bp26原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中高效表达,免疫印迹和间接ELISA实验证明BP26重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清产生特异性结合。结论成功获得了布鲁氏菌中序列全长为696bp,编码232个氨基酸的BP26蛋白,通过血清学反应证实,该蛋白为人和动物布鲁氏菌病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的表达及抗原性分析

目的在原核系统表达并初步鉴定细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因重组蛋白的抗原性。方法对已构建的重组质粒pMD-18T-EgTPx进行限制性酶切,获取目的基因片段后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-EgTPx,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法和ELISA鉴定重组EgTPx蛋白的抗原性。结果构建的重组表达质粒pET30a-EgTPx阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确;含有pET30a-EgTPx重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为27 kDa,而且主要以包涵体形式存在;Western-blot和ELISA结果表明EgTPx重组抗原可以被棘球蚴感染羊阳性血清特异性识别。结论成功构建了pET30a-EgTPx表达质粒,EgTPx重组蛋白得到了高效表达,表达产物具有良好的抗原性。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的 构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒，分析其表达状况。 方法 采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列，经克隆后，亚克隆至原核表达载体中，构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒，分析GRA8的表达；将各重组菌进行诱导，将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白，免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性。 结果 GRA8基因被正确插入原核表达质粒中，原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低，几乎无完整GRA8的表达，截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。 结论 GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低，纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆、表达与鉴定

目的 对刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶基因（NTPase）进行克隆、表达和鉴定。 方法 采用PCR扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM?-T Easy载体，经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB，并转入大肠埃希菌(E.coli)BL21（DE3）中进行诱导表达。用镍-次氮基三乙酸亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析蛋白表达产物。 结果 PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列，经测序鉴定无基因突变。SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达，其融合蛋白相对分子质量（Mr）约70 000，与理论值相近。Western blotting分析结果显示，纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清识别。 结论 所克隆表达的弓形虫NTPase-Ⅱ重组蛋白具有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

幽门螺杆菌唾液酸结合黏附素（SabA）的克隆表达

[摘要] 目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,简称H.pylori或HP）唾液酸结合黏附素（sialic acid-binding adhesion,SabA）的重组质粒,并在大肠杆菌BL21中表达,为探讨SabA的功能及相关疫苗的发展提供帮助。方法：以HP 26695株基因组为模板,设计sabA基因特异性引物扩增目的基因,将PCR产物插入到pGEX-4T-1载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达。表达蛋白经飞行质谱鉴定,并用免疫印迹法评价其抗原性。结果：经SDS-PAGE和飞行质谱鉴定,该表达蛋白为HP外膜蛋白,经免疫印法迹检测具有良好的抗原性。结论：成功克隆了HP的SabA,并能在大肠杆菌BL21中表达,该蛋白具有良好的抗原性。     

空肠弯曲菌AhpC蛋白的克隆表达及抗原性分析

目的构建空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶（ahpC）基因的原核表达系统,克隆表达AhpC蛋白,用Western blot以及ELISA方法检测表达蛋白的抗原性,为筛选空肠弯曲菌感染后特异性抗体检测试剂的制备奠定基础。方法用PCR方法从中国分离菌株ICDCCJ07001的染色体DNA中扩增出ahpC基因,将目的基因插入表达载体pGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导重组质粒pGEX-ahpC的表达。SDS-PAGE分析表达产物,采用GST标签亲和层析柱纯化表达蛋白。应用兔免疫血清、临床感染者血清以及健康无感染者血清,利用Western blot以及ELISA的方法分析AhpC蛋白的抗原性并初步评价其在ELISA检测方法中的应用。结果 PCR扩增及双酶切鉴定证实重组质粒构建成功。重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为空肠弯曲菌AhpC蛋白,Western blot及ELISA检测结果显示AhpC具有特异抗原性。结论成功构建了ahpC重组表达载体pGEX-4T-1/ahpC,并在大肠杆菌中高效表达。空肠弯曲菌AhpC蛋白具有抗原性,可以作为空肠弯曲菌感染后血清抗体检测的特异抗原。