低剂量电离辐射诱导转录因子NF-κB活化及其信号通路的实验研究

目的 研究低剂量电离辐射对转录因子NF—κB DNA结合活性的影响，探讨NF—κB结合活性信号传导通路的机理。方法 采用凝胶电泳移动变化分析及免疫组织化学的方法检测了X射线照射后FL-4细胞NF—κB DNA结合活性的时程变化及p65核转位、IκBα水平的变化，同时用脂质体介导的瞬时转染法将空质粒和NF-κB-荧光素酶表达质粒转染到NIH3T3细胞内，并用PKC信号通路阻断剂Calphostin C处理，检测受照后其荧光素酶的表达变化。结果 0．075Gy X射线照射可诱导NF—κB、p50／p65和p50／p50活性增强，而前者活性增强更明显。这种转录激活能力的增强，涉及到辐射诱导的p65核转位和IκBα水平的变化，表现为受照后p65亚基核阳性率明显升高，而IκBα水平的变化正相反，在照后4h分别达到峰值和低谷。而且PCK信号通路阻断剂Calphostinc可降低0．075Gy照射对NF—κB的活化效应。结论 低水平照射诱导NF-κB的迅速活化，而且可能通过PKC通路，进而调节细胞因子等特异基因的表达，促使免疫功能增强，这可能是低剂量辐射兴奋效应的机理之一。     

糖皮质激素抑制辐射诱导P388细胞NF-κB活化

目的 研究糖皮质激素对辐射诱导P388白血病细胞凋亡与NF－κB活化的影响。方法 采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡；采用电泳迁移率变动分析（EMSA）检测P388细胞NF－κB活化水平。结果 2，4，6和8Gy辐射诱导P388细胞凋亡，同时使NF－κB活化。地塞米松（DXM）增强由2，4，6和8Gy辐射诱导的P388细胞凋亡，抑制由2，4，6和8Gy辐射诱导的P388细胞NF－κB活化，凋亡增加率分别为60％，100％，129％和67％，NF－κB活化抑制率分别为25％，45％，52％和40％。结论 辐射诱导P388白血病细胞凋亡的同时激活NF－κB；糖皮质激素可通过抑制NF－κB活化，增强其诱导白血病细胞凋亡的作用。     

核因子—κB在内毒素刺激大鼠肺泡巨噬细胞中的动态变化及其在肿瘤坏死因子—α表达中的作用

目的 观察内毒素(LPS)刺激对大鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AM)中核因子—κB(NF—κB)活性的影响，探讨NF—κB在LPS刺激大鼠AM表达肿瘤坏死因子—α(刀NF—α)中的作用。方法体外观察LPS刺激大鼠AM中NF—κB活性的动态变化，应用圈套策略观察NF—κB在LPS刺激大鼠AM表达刀NF—α中的作用。结果LPS刺激可使大鼠AM内NF—κB明显活化，并与LPS剂量正相关；抗体超迁移率实验结果显示p50、p65参与了NF—κB的活化；NF—κB的圈套硫代寡核苷酸(S—ODN)能明显抑制LPS刺激大鼠AM表达TNF—α，但不能完全阻断LPS诱导的TNF—α表达。结论 NF—κB(p50／p65)在LPS介导的炎症反应中发挥重要作用，LPS刺激大鼠AM表达TNF—α受NF—κB调控，但其他核转录因子可能也在TNF—α的表达中发挥重要作用。     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β(IL-1β)诱导人气道上皮细胞人β防御素-2(hBD-2)的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子κB(NF-κB)活性的变化,探讨人气道上皮hBD-2表达的分子机制. 方法用IL-1β和(或)NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞,RT-PCR法检测hBD-2 mRNA的表达,Western blot检测胞浆I-κBα蛋白,凝胶迁移实验(EMSA)检测NF-κB活性的变化. 结果加入IL-1β 1μg/L刺激0.5h,可见I-κBα活性降低;刺激1.5h可见hBD-2 mRNA表达.NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达,EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录.结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达,NF-κB p65/p50异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控.     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β（IL-1β）诱导人气道上皮细胞人13防御素2（hBD-2）的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子KB（NF-κB）活性的变化，探讨人气道上皮hBI〉2表达的分子机制。方法用IL-1β和（或）NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞，RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达，Western blot检测胞浆I-κBa蛋白，凝胶迁移实验（EMSA）检测NF-κB活性的变化。结果加入IL-1β 1μg／L刺激0．5h，可见I-κBa活性降低；刺激1．5h可见hBD-2 mRNA表达。NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达，EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录。结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达，NF-κB p65／pS0异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控。     

PM2．5通过活化 NF－κB 途径诱导支气管上皮细胞中血管内皮生长因子的表达

目的：探讨细颗粒物（particulate matter 2．5,PM2．5）诱导支气管上皮细胞（bronchial epithelial cell,Beas－2B）表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的分子机制。方法 PM2．5粉末溶解于DMEM培养基中,倍比稀释成不同浓度（0、12．5、25、50、100μg／ml）的溶液,超声30 min后加入血清及双抗（链霉素和青霉素）,使终浓度为2％血清的体系,刺激人支气管上皮细胞;双荧光素酶报告基因分析系统检测核因子－κB （nuclear factor－kappa B,NF－κB）活化水平和vegf基因启动子的转录活化水平;Western印迹检测NF－κB组成亚基p65磷酸化水平、阻遏蛋白IκBα及VEGF蛋白表达水平。结果 PM2．5呈剂量依赖性诱导Beas－2B细胞VEGF表达;PM2．5诱导Beas－2B细胞中NF－κB活化,在浓度为100μg／ml活化强度最高,阻遏蛋白IκBα降解和p65亚基磷酸化水平升高;抑制NF－κB p65亚基表达后Beas－2B细胞VEGF蛋白表达水平下调,vegf基因启动子的转录活化水平下降。结论 PM2．5通过活化NF－κB途径诱导支气管上皮细胞中VEGF表达。     

哮喘豚鼠模型血淋巴细胞及嗜酸细胞与肺微血管内皮细胞粘附性的研究

观察哮喘豚鼠模型哮酸细胞和淋巴细胞与肺微血管内皮细胞的粘附率，探讨肺微血管内皮细胞在豚鼠模型血清孵育下的功能变化及淡症细胞与其粘附的分子基础，设豚鼠哮喘模型及对照组观察分 离的外周血淋巴细胞和哮酸细胞与内皮细胞的粘附率，RT－PCR法测定内皮细胞VCAM－1及eotaxin mRNA的表达强度，EMSA法测定NF－κB的AP－1的DNA结合活性，与组血清孵育相比，肺微血管内皮细胞在模型组血清刺激下；（1）与两组外周血淋巴细胞及仅与模型组哮酸细胞的粘附率显著升高（P＜0．01）；（2）VCAM－1和eotaxin mRNA表达量显著增多（P＜0．01或P＜0．05），NF－κB和AP－1的DNA结合活性也显著升高（P＜0．01），肺微血管内皮细胞可被哮喘模型血清激活，使粘附分子，趋化因子及核转录因子的合成和分泌显著增多，从而显著提高其与炎症细胞的粘附率，哮酸细胞的粘附需其自身及内皮细胞两者激活，肺微血管内皮细胞活化及NF－κB的和AP－1的DNA结合活性增高在哮喘发病中可能起重要作用。     

高尔基蛋白73参与炎症反应的分子机制研究

目的：通过研究高尔基蛋白73（GP73）对炎症反应的影响,揭示其参与肿瘤发生发展可能的机制。方法基于TCGA数据库中肝癌患者的GP73与炎症因子NF－κB、IL－1β、IL－6、TNF－α等基因表达相关性的分析,推测GP73可能参与炎症反应。依据数据分析结果设计细胞实验,构建过表达GP73的质粒和敲低GP73的小干扰RNA （ siRNA）,通过检测野生型、过表达和敲低表达GP73细胞系中NF－κB的转录活性以及炎症因子IL－1β、IL－6、TNF－α等基因的表达,来验证GP73在炎症反应中发挥的作用。结果 TCGA数据库分析结果提示,临床肝癌患者的GP73基因表达与NF－κB、IL－1β、IL－16及TNF－α的表达均呈正相关;细胞实验结果显示,过表达GP73细胞系与野生型相比,细胞内NF－κB转录活性升高,而敲低GP73细胞系内NF－κB转录活性降低;过表达GP73细胞系与野生型相比细胞内IL－1β、IL－6及TNF－α的表达均升高;二硫代氨基甲酸吡咯烷（ PDTC）能抑制GP73激活炎症反应,NF－κB为GP73激活炎症反应的关键分子。结论 GP73可能参与炎症反应,并因此促进肿瘤的发生发展。     

大蒜素对胃癌细胞NFκB活性的影响

目的研究大蒜素对肿瘤细胞中核转录因子B(NFκB)活性的影响,探讨大蒜素抗肿瘤的作用机制.方法用凝胶滞留(EMSA) 方法分析应用大蒜素处理前后人胃癌细胞系BGC-823的细胞核蛋白中NFκB的DNA结合活性. 结果用大蒜素处理后可观察到肿瘤细胞有增殖减慢及诱导分化等现象,大蒜素处理后NFκB结合DNA的活性降低.结论大蒜素的抗肿瘤作用可能是通过NFκB信号途径起作用的.     

富氢水对电离辐射引起胸腺细胞损伤的影响

目的 探讨富氢水对6 Gy照射小鼠胸腺细胞内活性氧水平、细胞凋亡及DNA损伤程度的影响。 方法 实验分为对照组、6 Gy照射组、6 Gy照射+富氢水组;对照组和6 Gy照射组小鼠照射前10 min灌胃正常饮用水0.5 ml,6 Gy照射+富氢水组小鼠灌富氢水0.5 ml,照射后连续灌胃,给予小鼠正常饮用水和富氢水7 d,于照射后4、7、15 d处死小鼠获取胸腺细胞。采用流式细胞术检测胸腺细胞内活性氧水平、凋亡细胞比例及磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）平均荧光强度。 结果 与对照组的小鼠比较,6 Gy照射组小鼠在照射后4、7、15 d胸腺细胞中的活性氧水平升高,早期凋亡细胞[AnnexinⅤ阳性、碘化丙啶（PI）阴性]和晚期凋亡细胞（AnnexinⅤ阳性、PI阳性）的细胞比例明显增加,γ-H2AX平均荧光强度增加。与6 Gy照射组小鼠相比,6 Gy照射+富氢水组小鼠的胸腺细胞中活性氧水平下降,早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例降低,细胞内γ-H2AX平均荧光强度则是下降的,差异均具有统计学意义。 结论 富氢水可以有效减轻电离辐射引起的胸腺细胞损伤,为富氢水作为辐射损伤防护剂提供了实验依据。