致病性大肠杆菌绿色荧光蛋白标记

目的:用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记致病性大肠杆菌(enteropathogenic escherichia coli,EPEC),以方便研究细菌的黏附。方法:以真核表达载体p EGFP-C1为模板设计引物,采用PCR方法扩增EGFP基因并测序后,克隆入原核表达质粒载体p Trc99a,转染EPEC,用荧光显微镜观察IPTG诱导后EPEC对Hep-2细胞的黏附及荧光表达情况。结果:成功构建原核表达质粒p Trc99a-EGFP和菌株EPEC/EGFP,黏附到Hep-2细胞表面的细菌克隆能够表达绿色荧光蛋白。结论:对EPEC进行了EGFP标记,为计数细菌的黏附提供方便。     

大鼠Nogo基因片段的克隆及与GST融合蛋白的表达和纯化

目的: 获取大鼠Nogo基因片段并高效表达纯化. 方法: 用RT-PCR技术,从成年SD大鼠脊髓的总RNA中,获得编码Nogo基因功能片段的DNA. 测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体,并导入E. coli DH5α中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白. 对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化. 结果: 获得成年SD大鼠Nogo(570～691和1028～1089氨基酸残基)的基因,测序结果与已发表的基因序列相一致. 重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr) 39 000和32 000处,有特异的蛋白条带. 重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白. 结论: 成功克隆成年大鼠Nogo基因片段,并在E. coli DH5α中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白.     

穿透支原体P35蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的为研究穿透支原体(Mpe)35 kD脂质相关膜蛋白(P35)的生物学活性,构建其原核细胞表达载体,并在大肠杆菌(E.coli)中表达.方法 PCR扩增p35基因片段,克隆至pQE31载体, 用PCR介导的突变将p35基因中两个“TGA”终止密码子定点突变为“TGG”,使其在E.coli中编码表达色氨酸.IPTG诱导pQE31/P35在E.coli 中表达目的蛋白rP35,经Ni-NTA Spin亲和纯化, Western blot分析鉴定表达产物. 结果 PCR扩增出约1kb的DNA片段,克隆至pQE31载体,筛选到阳性克隆pQE31/P35,测序分析 p35基因中两个“TGA”终止密码子成功突变成“TGG”. IPTG诱导pQE31/p35在E.coli 中表达分子量约37.4 kD的蛋白质,Western blot分析鉴定其为rP35. 结论构建的pQE31/p35原核表达载体,在E.coli中成功地表达rP35.     

人内皮抑素基因的质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的:将人内皮抑素(endostatin)基因插入表达载体并进行原核表达.方法:将endostatin基因定向插入表达载体pQE-31 BamH I/Kpn I位点,构建重组质粒pQEN,转化E.coli M15,进行原核表达.结果:在IPTG的诱导下,endostatin基因在重组转化株E.coli M15 (pQEN) 中获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量为22×103 u,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的34.6%.结论:从组织中克隆endostatin基因并进行原核表达是可行的方法.     

小鼠IL-35基因的克隆及原核表达

目的 克隆小鼠mIL-35两亚基mEBI3,mIL-12p35 cDNA,并构建mIL-35基因的原核表达载体并进行诱导表达.方法 RT-PCR方法从RAW246.7细胞中扩增mEBI3基因及脂多糖体外刺激BALB/c小鼠的脾细胞中扩增mIL-12p35基因,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35基因,并构建原核表达载体pET-30a-mIL-35,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的蛋白的表达.结果 成功克隆了mEBI3、mIL-12p35 cDNA,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35片段,并构建出原核表达载体pET-30a-mIL-35;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为50 000的重组mIL-35蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中.结论 利用构建的原核表达载体pET-30a-mIL-35成功表达出mIL-35蛋白,为进一步探讨mIL-35的生物学功能奠定了基础.     

抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础.     

尿酸酶基因工程菌的构建与分泌表达

目的：将产朊假丝酵母菌尿酸酶编码基因克隆至已改造的表达载体pET-28a中,使尿酸酶在大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）中以分泌的形式持续表达,并具有生物学活性。方法：①利用重组PCR技术删除pET-28a中Lac O和Lac I序列构建表达载体;②金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A,SPA）信号肽编码基因与尿酸酶基因N端融合成目的基因;②将目的基因克隆至表达载体中,再转化至E.coli DH5ɑ中,使之表达;④利用SDS-PAGE鉴定并测定表达产物生物学活性。结果：尿酸酶在E.coli中以分泌的形式持续表达,并具有生物学活性。结论：利用肠道内正常菌群 E.coli构建可分泌、持续表达蛋白的载体pET-28a-sUOX,可将表达的尿酸酶作用于高尿酸血症模型上,为应用于动物实验通过肠道降低尿酸水平提供依据。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

幽门螺杆菌18 000u外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的　构建含幽门螺杆菌 (Hp) 180 0 0 u外膜蛋白编码基因的重组载体并在 E.coli BL2 1中表达 .为 Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础 .方法　用 PCR从 Hp染色体中 ,扩增 180 0 0 u外膜蛋白编码基因片段 .将目的基因与 p ET32 a(+)同时经 Bam H I,H ind 双酶切、纯化、连接 ,转化含有目的基因的重组载体 .以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌 BL2 1(DE30 )并表达 .表达产物经纯化后 ,用 EL ISA法检测其抗原性 .结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为 Hp 180 0 0 u的外膜蛋白编码基因 ,与 Tomb等报道相比较…     

血链球菌丙酮酸氧化酶基因表达克隆的构建与鉴定

目的　构建血链球菌丙酮酸氧化酶基因 Sopox的表达质粒 ,为研究丙酮酸氧化酶基因 Sopox表达的调节奠定基础。方法　将从血链球菌 ATCC10 5 5 7克隆的丙酮酸氧化酶基因 Sopox重组到 p BV2 2 0 ,表达载体 ,并转化入大肠杆菌 E.coli JM10 5 ,观察 Sopox基因在大肠杆菌中的表达。结果　通过酶切后电泳鉴定 ,Sopox基因重组入 p BV2 2 0并转化入 E.coli JM10 5 ;经 42℃诱导后 ,SDS- PAGE显示 p BV2 2 0 / Sopox/ JM10 5表达分子量约为6 5 kd的蛋白 ,与根据 Sopox基因 DNA序列预测的蛋白分子量一致 ;p BV2 2 0 / Sopox/ JM10 5的蛋白表达在 42℃诱导 4小时后达高峰。结论　丙酮酸氧化酶基因 Sopox已被成功地克隆到 p BV2 2 0 ,并在 E.coli JM10 5中表达     

ret基因真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的:构建ret基因真核表达载体pcDNA3.0-RET,为制作转基因动物提供实验基础.方法:利用HandⅢ及NotⅠ限制性核酸内切酶,消化pSK-RET及pcDNA3.0空质粒,获得目的基因及相应载体;通过T4连接酶重组DNA;通过氨苄青霉素(Amp)抗性、酶切鉴定及DNA序列分析,确定阳性克隆.通过脂质体包裹转染NIH3T3细胞,采用Western blot方法检测载体的瞬时表达状况.结果:Amp抗性筛选阳性;酶切片段电泳分析在5 400 bp及3 300 bp处有明显条带;DNA序列分析提示重组基因与实际序列一致;Western blot结果显示175 000处有明显条带.结论:ret基因真核表达载体pcDNA3.0-RET构建成功,并可瞬时表达.     

9 ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达

目的:构建能分泌表达人9 ku颗粒溶素(granulysin)的真核质粒,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础.方法:以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR,双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.结果:成功扩增出含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9 ku颗粒溶素.结论:成功构建能分泌表达9 ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1-S9K.     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

长非编码RNA的研究进展

基因表达与调控方面的研究改变了我们对RNA的认识。近年的研发现,长非编码RNA(lncRNA通常大于200碱基而区别于microRNA)参与了一些重要的生命过程,包括染色质修饰、基因转录和转录后调节、蛋白质的活性调节和亚细胞定位以及细胞结构的维持等。新的发现引起越来越多的重视,但这些仍只是非编码RNA的一小部分,人们相信随着研究的深入,lncRNA的调控网络将渐渐浮出水面,不仅对我们认识生命过程的新调节层面有很大帮助,而且具有极大的应用潜力,例如用于基因治疗等方面。     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.     

小鼠内皮抑制素原核表达质粒的构建及表达

内皮抑制素具有强烈的抑制新生血管形成的作用，其主要在肝脏合成。提取小鼠肝细胞总RNA，设计合适的引物，用RT－PCR扩增出小鼠内皮抑制素cDNA片段，插入原核表达载体pRSET-A中，构建出重组质粒pRSET-ES。将其转化入大肠杆菌DH5α中扩增，质粒酶切筛选，DNA测序予以证实。重组质粒转化入大肠杆菌BDPS中，经IPTG诱导，SDS－PAGE检测到约19.8ku大小的融合蛋白。     

树突状细胞表面钙网蛋白的组成性和诱导性表达

目的检测树突状细胞（DC）表面钙网蛋白（CRT）的组成性和诱导性表达,并初步分析细胞表面CRT在DC分化及免疫应答中的作用。方法 AriaⅢ流式分选仪分选出C57 BL/6小鼠脾脏来源的DC,以荧光素标记的CRT多抗和CRT单克隆抗体染色,检测静息态DC表面CRT的组成性表达;静息态DC在体外以脂多糖（LPS）刺激培养24 h后,同样以抗体染色法,流式细胞仪检测培养后DC表面CRT表达量的变化;并检测DC诱导活化前后细胞表面CD86表达量的变化,以确定诱导前后DC的分化状态。结果静息态DC表面能检测到CRT的低水平组成性表达;LPS体外刺激能够有效诱导DC成熟,促使其高表达CRT,商品化CRT多抗和CRT单抗流式检测结果趋势一致,LPS能够诱导DC活化,成熟DC表面CD86的表达量较静息态DC显著提高。结论 CRT表达于静息态及活化态DC细胞表面,在LPS诱导下表达量会明显增加,初步提示在某些疾病状态下,DC细胞膜表面CRT表达量明显提高的状态,可能与其免疫学功能及某些病理状态相关,如抗原提呈、诱导T细胞分化等。     

人白细胞介素21的原核表达及初步纯化

目的利用PCR技术从人扁桃体细胞cDNA中克隆出IL-21编码基因,并将其在原核细胞大肠杆菌中进行表达,并进行了初步纯化.方法以人扁桃体细胞经PHA刺激的cDNA文库为模板,经PCR获得IL-21全基因片段.测序确认后,分别设计含BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的引物,经PCR获得IL-21成熟肽的编码基因.将此IL-21基因插入表达载体pGEX-4T-2,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α进行IPTG诱导表达.用琼脂糖珠结合的方法纯化.结果琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的PCR和双酶切产物与理论大小相等.SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α亦表达一与理论相符的条带.目的蛋白约占总菌体蛋白的10%.并获得了与理论值相符的纯化条带.结论成功地构建了IL-21编码基因克隆载体并获得在原核细胞大肠杆菌中的成功表达,同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化的方法.     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.