生物素标记HBV RNA探针的制备及应用

本文首次采用SP_(65)特殊质粒与人类的乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)重组。制备了Bio—HBV RNA探针,能特异地与HBV DNA杂交。并将该探针与缺口转移(Nick—translation)方法标记的Bio—HBV DNA探针进行了比较。结果显示出Bio—HBV RNA探针的敏感性比Bio—HBV DNA探针的敏感性提高10倍。本实验还分别应用了两种探针同时检测了70例乙肝病人血清中HBV DNA。阳性率各为31.42％,28.57％(P>0.25)。并对Bio—HBV RNA探针应用于临床检测乙肝病毒DNA的效能进行了初步的探讨。     

定量聚合酶链反应检测HBV感染患者血清HBV DNA的临床意义

采用信号引物能量转换定量聚合酶链反应（PCR）检测104例不同HBV感染患者血清HBV DNA含量。结果：不同HBV感染患者HBV含量范围在10^4.49-10^9.93拷贝／ml，其中急性乙肝含量显著低于慢性乙肝、乙肝后肝硬变和原发性肝癌患者的含量（P＜0.05和P＜0.01)；HBeAg( )患者的含量显著高于HBeAg(-)／抗－HBe( )患者的含量（P＜0.001)；相关分析显示：血清HBV DNA含量与血清ALT水平无明显相关。结论：HBV感染的慢性化可能与血清HBV DNA含量高有关，肝损伤与血清HBV DNA含量无明显关系；e系统血清传换后，HBV并未停止复制，只是复制水平降低，应用定量PCR检测血清HBV DNA含量有助于HBV感染患者预后的判断和重新评价HBV感染的自然史及HBVM的临床意义。     

一种国产基因芯片用于乙型肝炎病毒P基因突变的检测

目的：验证国产基因芯片检测HBV—P基因突变的准确性和敏感性。方法：选择14例服用拉米夫定48周时HBV—DNA定量检测仍阳性的慢性乙型肝炎病人的血清标本，用HBV基因突变检测基因芯片检测患者血清中HBV—DNA聚合酶基因，观察发生YMDD变异的情况。同时用聚合酶链反应(PCR）技术扩增上述血清标本中编码HBV—DNA聚合酶的P基因片段并直接测序，以对比检查P基因发生YMDD变异的情况。结果：14例患者血清标本用基因芯片均检出HBV—DNA，9例为野生株，5例发生YMDD变异，其中3例为M552I(YIDD)变异，2例为M552V(YVDD)变异，同时均伴有L528M变异。与用PCR扩增产物直接测序的结果完全相同。结论：国产HBV基因突变检测芯片具有特异性强、灵敏性高、快速、简便等优点，可以替代繁琐的DNA序列测定和分析，可作为临床监测HBV—DNA变异的常规方法。     

用原位聚合酶链反应检测肝癌石蜡包埋组织中的HBV—DNA

为研究乙型肝炎病毒(HBV)感染和肝细胞癌(HCC)之间的关系,我们建立了原位聚合酶链反应(ISPCR)并检测26例HCC石蜡包埋组织中的HBV—DNA。结果显示,HBV DNA在肝癌组织和癌旁肝组织的阳性率分别为84.6％(22/26)、91.3％(21/23)。ISPCR技术既显示了PCR技术的高敏性和特异性,又能在细胞内定位,是研究HBV与HCC关系的一项有价值的技术。     

PreSlAg、HBeAg和HBV—DNA的对比检测与分析

目的：通过对比检测和分析739份血清中preS1蛋白、HmAg和HBV—DNA的检测阳性率，为临床正确选用实验室指标防治乙型肝炎提供依据。方法：应用ELISA法对739份血清进行PreSlAg和HBV血清标志物检测，并与实时荧光定量PCR检测HBV—DNA结果进行比较。结果：所有739份血清中，PmSlAg阳性率为34．6％（256／739），HmAg阳性率为觚7％（227／739），HBV—DNA阳性率为58.9％（435／739）。227份HBeAg阳性血清中，PreSlAg阳性率55．9％（127／227），HBV-DNA阳性率96．0％（218／227）；512份HBeAg阴性血清中，PreSlAg阳性率25．2％（129／512），HBV—DNA阳性率为42．4％（217／512）。HBeAg、HBV—DNA和PreSl的阳性率有显著差异（P〈0．05），阳性率高低依次为HBV—DNA〉PreSl〉HBeAg；HBeAg阳性血清中PreSlAg（55．9％）阳性率显著高于HmAg阴性血清PreSlAg（25．2％）阳性率（x^2=36．5，P〈0．01）；HBV—DNA阳性血清的PreSlAg检出率58．9％（256／435）显著高于HBV—DNA阴性血清的PreSlAg检出率1＆4％（56／304）（P〈0.01）；PreSl抗原与HBV—DNA阳性符合率为（200／256）7＆1％，阴性符合率为（248／483）51．3％。598份HBeAg阳性血清（阳性率为80．9%，598／739）中HBeAg、PreSl和HBV—DNA阳性数（率）分别是224（37．5%）、253（42．3oA）、417（69．7％）。结论：PreSlAg、HBV—DNA、HBeAg的阳性率有显著性差异（P〈0．05）。作为HBV感染和复制的指标，以检测HBV—DNA最为可靠，而PmSlAg可能较HBeAg更敏感。在HBV感染的不同时期，如何理解和使用上述指标对防治乙型肝炎有重要意义。     

孕妇乙型肝炎血清病毒标志物和HBVDNA测定及临床意义

目的探讨孕妇乙型肝炎病毒（HBV）感染者血清病毒标志物（HBV～M）组合与HBV DNA的关系以便指导免疫干预而阻断母婴传播。方法采用ELISA检测乙肝病毒血清学标志物（HBsAg、HBsAbHBeAgHBeAbHBcAb）,实时荧光定量PCR（FQ—PCR）对268例孕妇检测感染者血清中HBV DNA含量。结果HBsAg阳性组HBVDNA阳性率为49．4％（83／168）,HBsAg阴性组HBV DNA阳性率为11．10％（11／100）,两者差异显著（P〈0．01）,但HBsAg（-）组HBV DNA阳性数占总数中的11．7％（11／94）。结论临床仅根据HBV血清标志物抗原抗体的检测来判断病人的传染性是不全面的,应重视HBsAg阴性低水平HBV复制患者,结合HBV DNA的检测结果进行综合判断,以免造成宫内HBV感染。进行预防接种阻断HBV母婴传播。     

实时荧光定量PCR测定HBV-DNA的方法和临床意义

HBV—DNA定量是目前诊断乙型肝炎、判断病毒复制和评价患者肝脏病变、预后及药物疗效的重要指标之一，但在指导诊疗时仍需结合血清标记物、肝损害指标乃至HBV基因分型。HBV—DNA定量的方法有PCR核酸探针杂交法、R．ELISA、竞争定量PCR、实时荧光定量PCR，本文综述定量检测HBV—DNA意义及PCR检测方法。     

乙型肝炎病毒前S_1蛋白及其抗体测定的临床价值分析

近年来,对乙型肝炎病毒前S_1蛋白抗原及其抗体的研究进展较快,并发现其抗原在HBV感染肝细胞后引起机体的免疫反应有重要作用。为其评价前S_1蛋白及其抗体的检测对乙型肝炎的诊断价值及临床意义,我们采用ELISA法检测前S_1蛋白及其抗体对110例乙肝病毒感染者及50例健康人群进行检测,同时用检测HBV—DNA(PCR法)及各种乙肝病毒的血清学模式,现报告如下。1 材料与方法1.1 受检对象110例患者均来自于本院门诊及住院患者,HBV血清学感染模式阳性程度不等。健康对照人群50例,其中30例为     

用Blot杂交技术检测11例乙肝及肝癌患者尸解多种组织的HBV—DNA

尽管嗜肝性作为乙型肝炎病毒(HBV)的生物学活性之一已得到公认,并且HBV归属于肝DNA病毒科(HAPADNAVIRIDAE),但近年来的一些动物实验和临床研究表明:除了肝细胞之外,还可在其它组织中检测到HBV抗原和DNA,包括它的复制形式。这对于研究HBV感染的慢性持续状态、受染者的免疫异常、及感染的传播途径等具有一定价值。为此,我们采用Southern blot杂交技术,对11例乙肝及肝癌患者的尸解多种组织进行了     

PCR法检测慢性乙肝患者外周血单个核细胞中HBV-DNA

目的：了解慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMCs）HBV的感染情况及其与血清HBV的关系。方法：采用聚合酶链反应（PCR）检测55例慢性乙型肝炎患者PBMCs和血清中HBV。结果：PBMCsHBV－DNA检出率为69％（38例／55例），血清HBV－DNA检出蓄为36％（20例／55例），PBMCsHBV－DNA与血清HBV－DNA无一致性，P＜0．05，PCR法检测慢性乙型肝炎患者HBV－DNA、PBMCs检出率优于血清检出率，P＜0．05。结论：在慢性乙型肝炎患者中，PBMCs存在HBV－DNA。     

乙肝病毒外膜大蛋白检测及其对判定HBV DNA复制的意义

 目的 探讨血清乙肝病毒外膜大蛋白(LHBs)检测对于判定HBV DNA复制的临床意义.方法采用酶联免疫方法检测LHBs,Pre - S1和HBV M,采用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA.结果(1)在HBeAg阳性血清中,HBV DNA与LHBs、Pre -S1之间的阳性率差异均无统计学意义(P＞0.05);(2)在HBeAg阴性血清中,HBV DNA与LHBs的阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).HBV DNA与Pre -S1之间的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05);(3) 90份乙肝患者血清中LHBs水平与HBV DNA拷贝数呈良好相关性(r=0.918),Pre - S1水平与HBV DNA拷贝数的相关系数为0.765.结论 血清LHBs水平能反映HBV DNA复制程度,其与HBV DNA的相关性优于pre - S1,可作为评判HBV DNA复制新的血清学指标.     

乙型病毒性肝炎不同血清学模式前S1抗原、乙型肝炎病毒-DNA和肝功能指标的关系

目的检测乙型肝炎病毒（HBV）感染者不同血清学模式前S1抗原（pre-S1-Ag）、HBV～DNA和乙型肝炎抗原、抗体含量,结合血清肝功能（丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST）分析病毒性肝炎临床诊断、病情判断和预后。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测94例HBV感染者血清中pre-S1-Ag和乙型肝炎抗原、抗体,用荧光定量一聚合酶联反应（FQ-PCR）方法检测HBV-DNA含量,用全自动生化分析仪检测血清AI,T和AST指标。结果HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）模式的pre-S1-Ag检出率为79．4％,HBV—DNA检出率为97．1％,肝功能异常的为94．1％;HBsAg（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）模式的Pre-S1Ag检出率为52．4％,HBV—DNA检出率为83．3％,肝功能异常的为88．1％;在HBsAg（＋）和HBcAb（＋）模式中pre-S1-Ag检出率为33．3％,HBV—DNA检出率为66．7％,肝功能异常的为33．3％。结论HBV-DNA检测在反映乙型肝炎病毒复制情况的检出率明显高于HBVpre—S1-Ag,但是HBVpre-S1-Ag检测成本低廉,与HBV—DNA的符合度较高,是对乙型肝炎“两对半”和HBV—DNA测定的重要补充和加强。乙型肝炎抗原、抗体及HBV-DNA联合pre-S1-Ag检测可以提高HBV的检出率,更能真实地反映出HBV在体内的复制情况,为乙型肝炎患者的诊断、治疗和预后判断提供依据。     

乙型肝炎复制指标的相关性分析及其临床应用价值研究

 目的探讨HBeAg、HBcAg、Pres1Ag、HBcAb和HBV DNA的关系及其临床应用评价.方法Pres1Ag和HBV M检测采用酶免法,HBV DNA采用荧光探针技术定量PCR法,HBcAg采用固相放射免疫法.结果5项复制指标分别在HBV M不同模式组检出率不等同;HBcAb(+)组的HBV DNA和HBcAg阳性率显著高于HBcAb(-)的HBV M模式组(P<0.01);若以HBV DNA检测阳性为HBV复制金标准,HBcAg检测符合率(83.2%)显著高于其他指标(P<0.01),而HBcAb检测特异性和HBeAg检测灵敏度过低.结论(1)HBcAg与HBV DNA相关性最好.(2)5项指标评价HBV复制的临床意义为:HBV DNA>HBcAg>Pres1Ag>HBeAg>HBcAb.(3)HBcAb仅仅可作为HBV复制的初筛指标.     

女性乙型肝炎病毒携带者卵巢颗粒细胞中乙型肝炎病毒感染情况与临床检测结果分析

目的分析女性乙型肝炎病毒(HBV)携带者卵巢颗粒细胞中HBV感染情况与临床检测结果。方法选取自2014年1月至2016年1月于自贡市第三人民医院接受辅助生育治疗的40例女性患者作为研究对象,其中,20例患者为HBV携带者(携带组),20例患者为非HBV携带者(非携带组),分离患者卵泡液中的颗粒细胞并制成涂片。应用经地高辛标记的特异性HBV DNA探针,通过原位杂交对颗粒细泡涂片进行检测;应用碱性磷酸酶系统进行显色反应。结果携带组患者的颗粒细胞涂片显示,5例可见200个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出20个HBV DNA阳性细胞;6例患者可见220个片状、单层的颗粒细胞,细胞核中检测出8个HBV DNA阳性细胞;9例患者可见180个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出4个HBV DNA阳性细胞。非携带组患者的颗粒细胞涂片为阴性。显色10 min时,患者未出现阳性信号;显色20 min时,4例患者出现阳性信号;显色30 min时,3例患者背景着色较深,阳性信号不易辨认,忽略不计。因此,20 min为显色的最佳时间。结论女性HBV携带者卵巢颗粒细胞中具有HBV DNA,可通过生殖细胞向子代传播乙型肝炎。因此,应加强对HBV携带孕产妇的健康宣传教育,并采取有效措施进行阻断。     

DNA分子杂交法检测乙型肝炎患者血清中HBV—DNA结果分析

我们自1988年以来,采用~(32)P标记的HBV—DNA探针对634例乙型肝炎患者进行了HBV—DNA检测。现将结果报告如下。病例来源 634例乙型肝炎均为我科住院患者,经临床及实验室检查确诊的各型乙型肝炎患者。诊断标准均符合第四次全国病毒性肝炎会议制定的标准。     

原发性肝癌经肝动脉栓塞治疗后血清HBV DNA近期变化

目的 探讨原发性肝癌介入治疗后HBV DNA的变化及临床意义.方法 收集在本科行肝动脉化疗栓塞治疗(TACE)的伴有慢性HBV感染的肝癌患者56例,观察术后血清HBV DNA载量和肝功能的变化.结果 肝癌患者以HBsAg、HBeAb、HBcAb 3项阳性模式最常见(23/56),大部分患者HBV处于复制活跃状态(36/56).HBeAg(+)及HBeAg(-)模式血清HBV DNA载量差异有统计学意义(P<0.05).TACE可加重肝功能损害,使血清HBV DNA载量一过性升高(27/56),前者有显著性统计学意义(P<0.01),后者无统计学意义(P>0.05).术后4周有11例患者血清HBV DNA持续性升高(19.64%),与未升高患者肝功能比较,差异有极显著性统计学意义(P<0.01).结论 TACE可使部分伴有慢性HBV感染的肝癌患者HBV DNA复制激活,使肝功能损害加剧,术后定期监测血清HBV DNA载量变化具有重要的临床价值.     

慢性乙肝患者石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

目的建立慢性乙肝患者微量石蜡包埋肝组织共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)定量检测方法。方法以37例慢性乙肝患者甲醛固定石蜡包埋肝组织为研究对象,提取肝组织HBV DNA,经不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化后,利用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR扩增技术检测肝组织中HBV cccDNA含量,以β-actin为内参照。通过已知浓度的模板DNA进行梯度稀释鉴定该方法的灵敏度,并对该方法进行批内和批间重复性检测。应用该方法分析37例慢性乙肝患者肝组织HBV cccDNA与血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA的关系,以及肝组织HBV cccDNA和HBV DNA与血清HBeAg表达之间的关系。结果成功建立了微量石蜡包埋肝组织HBV cccDNA的定量检测方法,该方法具有较好的特异性、灵敏度和稳定性。HBeAg阳性者肝组织中cccDNA含量明显高于HBeAg阴性者,HBV cccDNA水平与血清总HBV DNA水平(R2=0.48,P=0.042)及肝组织总HBV DNA水平(R2=0.63,P=0.001)呈正相关。结论该方法可特异灵敏地定量检测微量石蜡包埋组织切片中的HBV cccDNA。     

乙型肝炎患者唾液中HBV-DNA的检测

近年来,从乙型肝炎患者唾液中检出HBsAg的报道已引起了人们对通过唾液传播乙型肝炎的关注。我们应用斑点杂交试验(又称~(32)PHBV-DNA探针)检测了46例乙型肝炎患者唾液中乙型肝炎发病(HBV—DNA),并与血清中HBV—DNA、HBsAg、HBeAg、抗HBe进行了对比观察。以7例非乙型肝炎患者作为对照,以探讨唾液传播乙型肝炎的流行病学意义。现报告结果如下:     

乙肝病毒外膜大蛋白检测的临床意义

目的:探讨乙肝病毒外膜大蛋白(HBV-LP)检测的临床意义.方法:随机选取203例乙肝患者血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV-LP、Pre-S1蛋白及HBV M,实时定量PCR方法检测HBV DNA.结果:LP的检出阳性率与HBV DNA的检出阳性率相关性具有统计学意义,且HBV DNA 拷贝数的对数值与HBV-LP 表达具有相关关系(r＝0.902);LP检出阳性率与Pre-S1蛋白检出阳性率差异具有统计学意义;不同HBV M模式检测LP检出阳性率差异不具有统计学意义,但26例HBeAg阴性患者血清LP检测为阳性.结论:血清中HBV-LP的含量与HBV DNA的拷贝数具有较好的相关性;血清中HBV-LP的检测是对HBV M检测的补充.     

HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测

目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平。结果地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠。HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平。肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量最高。结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠。