特异性标记胚胎干细胞分化的成血管细胞

克隆小鼠flk1基因启动子和增强子,构建成血管细胞特异性表达GFP载体,并转染小鼠胚胎干细胞(ES).将ES分化形成胚胎体(EB),观察EB中GFP表达,收集第4天的EB细胞进行流式细胞分析和分选,以获得GFP+细胞进行血细胞集落形成实验,以确定GFP标记细胞造血分化潜能.结果显示,成功构建成血管细胞特异性表达GFP载体;转染的ES形成的EB中可见绿色荧光细胞.流式细胞分析结果发现,转基因组EB中的GFP+细胞(27.5%)与对照组EB中FLK1+细胞(28.1%)比较差异无统计学意义;GFP+和FLK1+细胞形成集落数比较差异无统计学意义.表明对ES分化产生的成血管细胞实现了特异性标记,为后续研究ES体外造血分化的分子机制奠定了基础.     

AGM区基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化的实验研究

目的探讨主动脉-性腺-中肾(AGM)区来源的基质细胞诱导胚胎干细胞(ESC)向成血-血管干细胞分化的促进作用。方法从孕11 d的小鼠胚胎AGM区分离、培养基质细胞,鉴定后用作支持细胞,与小鼠胚胎干细胞共同培养,通过原始细胞集落(BL-CFC)的形成情况及流式细胞仪检测CD34 /Flt-1 细胞比例,评价AGM区基质细胞对小鼠ESC-D3细胞系向成血-血管干细胞的定向诱导作用。结果在AGM区基质细胞的支持下,由ESC来源的CD34 细胞由(12.71±1.76)%增加到(39.71±3.76)%,并且CD34 /Flt-1 细胞比例明显提高,达到(26.59±1.77)%;同时由ESC来源的代表成血-血管干细胞的BL-CFC集落增加了3倍。结论AGM区基质细胞可促进胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化,探明其机制对研究造血及血管发育机制有积极意义。     

人类胚胎干细胞向造血干细胞分化的微环境研究

目的 探讨胎肝基质细胞和骨髓基质细胞在诱导胚胎干细胞向血液血管干细胞分化中的作用,分析基因表达差异.方法 通过将分化4 d的EBs分别接种到以下两组中:(1)胎肝基质细胞层+细胞因子;(2)骨髓基质细胞层+细胞因子:诱导结束后,流式细胞术检测各组中血液血管干细胞标志KDR阳性细胞数以及造血干细胞标志CD34阳性细胞数,计数细胞分化过程中形成的造血干细胞样的集落数,比较诱导分化效果;收集胎肝基质细胞和胚胎骨髓基质细胞,采用cDNA芯片分析基因表达差异.结果 流式细胞术检测发现,两组中KDR+细胞的比例为分别为:(1.06±0.20)%、(8.8±1.49)%;CD34+细胞比例为分别为:(1.25±0.16)%、(9.19±2.10)%;血岛样集落数量分别为0.9±0.36、10.6±0.63;上述结果均以骨髓基质细胞联合细胞因子诱导方法效率最高.基因芯片(hBMSCs/hFLSCs)中总共有240条基因在骨髓基质细胞中高表达,397条基因的在肝脏基质细胞中高表达.对细胞因子、细胞黏附分子以及细胞外基质蛋白的基凶加以分析,结果发现在hBMSCs高表达的相关的21条基因,推测可能与造血分化相关.结论 人类胚胎十细胞向造血干细胞分化过程中,涉及到细胞与细胞之间的相互作用,相关的细胞因子、细胞黏附分子、细胞外基质蛋白等可能起重要的作用.     

人类胚胎干细胞向造血细胞的自发分化

目的 研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据.方法 将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、Bmil、Scl、gata2等的表达、流式细胞术检测6、8、10、12 d造血干细胞标志CD34表达,并通过造血集落培养方法检测这些时间点造血集落形成能力,最后将拟胚体制备石蜡切片,免疫细胞化学检测10、12、15、18 dCD45阳性阳性细胞数.结果 造血干细胞早期基因KDR、Bmil在hESCs中有表达,同时该基因随着拟胚体培养时间的延长,在第4～6天开始上调表达;造血干细胞标志性基因Scl,gata2在6～8 d开始表达,并且维持高表达到12 d.流式细胞术检测不同时间点hEBs中CD34阳性细胞数,发现其随时间的延长有增多的趋势,6、8、10、12 d分别为(1.4±0.4)%、(3.4±1.3)%、(5.5±2.2)%、(5.1%±1.7)%;6、8、10、12 d的拟胚体细胞进行集落培养检测形成的集落数在每105个拟胚体细胞中分别为0、7±2、37±11、89±29,P<0.01;集落细胞表达CD45,瑞士吉姆撒染色,可以检测到分叶核粒细胞;免疫细胞化学法对10、12、15、18 d拟胚体进行切片染色,发现在这4 d中可以明显观察到CD45阳性细胞的出现,并随时间的延长而数量增多,分别为:0、40.5±15.09、178.6±55.89、253.0±52.04,P<0.05.结论 在自发向造血细胞分化的过程中经历了 3个阶段:hESCs向胚层特异性细胞分化(前6～8 d);造血干祖细胞扩增期(第8～12天);成熟血细胞大量出现期(15 d以后).     

AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的树突状细胞诱导特异性抗肝癌免疫

目的: 以AFP基因转染CD34 造血干细胞来源的树突状细胞(DC),诱导DC产生特异性抗肝癌免疫,观察其对肝癌细胞的杀伤.方法: 采用化疗和集落刺激因子动员肝癌患者外周血造血干细胞,血细胞分离机采集CD34 造血干细胞,IL-4、GM-CSF联合TNF-α刺激CD34 细胞分化为DC.通过脂质体转染的方法将携带人AFP基因质粒pEGFP-AFP转染树突状细胞,MTT法检测对人肝癌细胞HepG2的特异性杀伤.结果: 经细胞因子刺激诱导培养的DC具有典型的分枝状突起,高表达CD11C,CD80,CD86.转染AFP基因后可见到转染细胞表达绿色荧光蛋白,细胞化学染色胞质内可见到红色颗粒.MTT法检测AFP基因转染后的DC可诱发特异性CTL反应杀伤HepG2细胞,AFP基因转染组、空载体组和对照组的杀伤率分别为(92.0±3.5)%,(75.5±4.1)%和(72.9±3.4)%,转染组与空载体组和对照组间存在显著性差异(P＜0.05).结论: AFP基因转染CD34 造血干细胞来源的DC可诱导特异性CTL反应杀伤肝癌细胞.     

IL-33转基因小鼠骨髓造血干/祖细胞向髓系细胞分化的能力增强

目的利用IL-33转基因小鼠研究IL-33对造血干/祖细胞的增殖和分化影响。方法利用流式细胞仪分析IL-33转基因小鼠及同窝野生对照小鼠的外周血、脾脏、骨髓细胞的免疫表型及造血干细胞分化不同阶段细胞的数量变化;利用体外成克隆实验和细胞周期分析研究IL-33对于造血干细胞增殖能力的影响。结果与野生型小鼠相比,IL-33转基因小鼠B细胞和T细胞在外周血中都明显降低,粒细胞在外周血和骨髓中都有明显增加;IL-33转基因小鼠的骨髓造血干细胞和多能祖细胞数量减少,共同淋系祖细胞数量减少,共同髓系祖细胞和粒单系祖细胞数量增加;IL-33转基因小鼠的造血干细胞处于S-G2-M的细胞增多;体外单克隆实验发现IL-33转基因小鼠造血干细胞形成的集落数增加。结论 IL-33转基因小鼠造血干细胞增殖能力增强,更易向髓系细胞分化。     

红细胞分化去核因子在诱导小鼠红白血病细胞分化以及恶性逆转中的作用

目的：研究小鼠红细胞分化去核分化因子（MEDDF）在红细胞终末分化中的功能。方法：构建在真核细胞中表达的重组质粒pcDNA-MEDDF,用其转染小鼠红白血病细胞系（MEL）,通过分析细胞的生长曲线,分裂指数及在半固体培养基中的集落形成率比较细胞的生长线性,采用RT－PCR检测c-myc及β-珠蛋白（β-globin)基因的表达。结果：转染pcDNA-MEDDF与转染空载体（pcDNA3.1)的细胞相比较,细胞的增殖率减慢,分裂指数降低,在半固体培养其中形成集落的数量减少,转染细胞的联苯胺阳性率达32．8％,用RT－PCR检测发现,转染细胞β-珠蛋白的表达量上升了3．43倍,o-myc表达量下降了66．3％,。结论：MEDDF能命名小鼠红白血病细胞分化并抑制其恶性变。     

体内扩散盒法培养正常小鼠骨髓干细胞

造血干细胞是生成血细胞的原始细咆,它是一个不均一的细胞群体,由于分化阶段的不同,造血干细胞又分为多向干细胞,如脾集落形成单位(CFU-S)和定向干细胞,如粒系定向干细胞形成单位(CFU-C)等。我们为了进行正常人及白血病患者骨髓干细胞的研究,首先用小鼠腹腔扩散盒法培养了正常小鼠骨髓干细胞,测定了正常小鼠骨髓 CFU-C 的相对数     

AANAT基因工程化ES细胞减少APP高表达PC12细胞Aβ的分泌

目的 构建AANAT基因工程化的胚胎干细胞，并探讨其在阿尔茨海默氏病治疗中的可能作用。方法 将外源性neo基因转染人胚胎成纤维细胞，作为饲养层细胞用于ES细胞转基因后筛选及增殖过程的培养。将pBK-CMV/AANAT真核表面质粒转染小鼠胚胎干细胞，用RT－PCR方法筛选阳性细胞克隆，用此工程细胞的条件培养液培养APP过量表达的PC12细胞，观察β淀粉样蛋白分泌情况。结果 （1）转入neo基因的人胚胎成纤维细胞能很好维持ES2细胞的未分化。（2）AANAT基因工程培养液能减少β淀粉样蛋白的分泌。（3）褪黑素能使PC12／APP细胞Aβ分泌明显减少。结论 首次构建AANAT基因工程化的胚胎干细胞，其减少Aβ分泌的作用可能在阿尔茨海默病的治疗中具有重要应用价值。     

bcl-2基因转染小鼠造血干细胞重建造血的生物学特性

目的 观察ｂｃｌ－２基因转染小鼠造血干细胞重建造血的小鼠对放化疗的抵抗作用。方法 （１）含ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导转染ＰＡ３１７包装细胞,通过Ｇ４１８筛选和克隆,获得高病毒滴度的细胞株（Ｄ３）;（２）用Ｄ３细胞株的病毒上清转染小鼠胚胎肝造血干细胞;（３）经致死剂量照射小全注ｂｃｌ－２转 造血干细胞重建造血;（５）采用脾集落形成和再增殖能力观察ｂｃｌ－２转因干细胞重建造血     

成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞血液血管干细胞特性观察

目的:检测脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞是否具有血液血管干细胞的特性.方法:将脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞分别于血管内皮及造血细胞诱导培养体系中培养,采用RT-PCR、免疫组织化学方法检测分析其生物学特性.结果:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在内皮细胞诱导体系中可分化为CD31 /vWF 细胞,在基底膜胶中可形成血管样结构;在造血诱导培养体系中可定向分化为表达GATA-1、GATA-2、β及γ珠蛋白的细胞,在甲基纤维素造血培养基中,这类造血细胞可定向分化为红系集落单位.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在体外可同时向血管内皮细胞和造血细胞分化,具有血液血管干细胞的特性.     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）过表达牙本质涎磷蛋白（DSPP）后的形态学改变，并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC，通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC，通过标记基因GFP检测转染效率，观察转染后细胞的形态学改变，RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC，经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42．7％，转染后的细胞出现分化，似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1／2、Pax9、Lhx6／7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col Ⅰ等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化，并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSC)过表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)后的形态学改变,并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC,通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC,通过标记基因GFP检测转染效率,观察转染后细胞的形态学改变,RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC,经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42.7%,转染后的细胞出现分化,似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1/2、Pax9、Lhx6/7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化,并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

L型钙离子通道Cav 1.2在大鼠根尖牙乳头干细胞成牙向分化中的作用

目的 探讨L型钙离子通道Cav 1.2在大鼠根尖牙乳头干细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中的作用。方法 利用酶消化法分离大鼠根尖牙乳头干细胞,体外扩增,结晶紫染色检测牙乳头干细胞的克隆形成率;利用慢病毒转染系统介导pLVX-shRNA2质粒在牙乳头干细胞中表达,抑制牙乳头干细胞中Cav 1.2基因的表达。荧光显微镜下观察转染牙乳头干细胞绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR及Western印迹法检测牙乳头干细胞中Cav 1.2基因沉默效率;矿化诱导体系下诱导Cav 1.2基因沉默牙乳头干细胞向成牙本质细胞样细胞分化,应用茜素红染色检测Cav 1.2对牙乳头干细胞成牙向分化的影响。结果 牙乳头干细胞的克隆形成能力为每200个细胞形成6~10个克隆;PCR及Western印迹法结果显示牙乳头干细胞Cav 1.2基因沉默效率达到70%;在牙乳头干细胞成牙向诱导第10天时,与对照组Luc-Cav 1.2相比,Cav 1.2基因沉默组成牙相关基因DSPP表达水平明显下降,同样茜素红染色结果显示Cav 1.2基因沉默牙乳头干细胞钙化结节形成也受到明显抑制。结论 L型钙离子通道Cav 1.2在大鼠根尖牙乳头干细胞向成牙本质细胞样细胞分化的过程中发挥着非常重要的作用。【摘要】目的 利用慢病毒转染系统构建Cav 1.2基因沉默的大鼠根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAPs),探讨Cav 1.2在大鼠牙乳头干细胞成牙向分化中的作用。方法 取3周龄SD大鼠,采用酶消化法获取大鼠根尖牙乳头干细胞,取第二代大鼠根尖牙乳头干细胞进行克隆平板实验鉴定其增值能力;采用慢病毒转染的方法构建Cav 1.2基因沉默Sh-Cav 1.2牙乳头干细胞及对照组Luc-Cav 1.2牙乳头干细胞, RT-PCR及Western印迹法鉴定其转染效率,并诱导其向成牙本质细胞样细胞分化;在成牙向诱导分化第10天,RT-PCR及茜素红S染色观察Cav 1.2对大鼠根尖牙乳头干细胞成牙向分化的影响。结果 分离获得较强增殖能力的大鼠牙乳头干细胞,其中每200个细胞可形成6~10个克隆;荧光倒置显微镜下转染48h,Sh-Cav 1.2及Luc-Cav 1.2均呈现绿色荧光,转染效率均达到90%;在两组细胞成牙向诱导过程中,实验组Sh-Cav 1.2牙乳头干细胞成牙相关基因DSPP的表达及钙化结节的形成均明显低于对照组Luc-Cav 1.2。结论 L型钙离子通道Cav 1.2对大鼠根尖牙乳头干细胞成牙向分化有重要作用。     

转LacZ基因骨髓间充质干细胞体内造血分化的初步研究

目的 初步探讨小鼠骨髓间充质干细胞在体内向造血细胞分化的潜能。方法 利用转LacZ基因小鼠MSCs输注X射线亚致死量照射的BALB／C小鼠，2个月后取骨髓细胞作体外甲基纤维素培养和X-Gal染色，取肝脏X-Gal染色。结果 MSCs输注组和对照组骨髓细胞体外集落培养均能形成鹅卵石样造血细胞集落，经X-gal组化染色后，输注组部分造血集落产生蓝绿色，对照组没有颜色变化。肝脏X-Gal染色输注组部分产生蓝色，对照组没有颜色变化。结论 小鼠MSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

小鼠胎儿成纤维细胞及胚胎干细胞转绿色荧光蛋白基因的研究

目的检测用增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）转染的小鼠胎儿成纤维细胞及小鼠胚胎干细胞的转染效率及EGFP的表达情况。方法电穿孔法将EGFP转入胎儿成纤维细胞及胚胎干细胞，G418筛选，荧光显微镜观察转染效率及绿色荧光蛋白表达情况。结果胚胎干细胞的转染率高于成纤维细胞，转染后的两种细胞经药物筛选均有绿色荧光蛋白表达。结论电穿孔转染细胞的方法简单、效率高，是一种较为理想的基因转染方法，经药物筛选后的两种细胞均可用于核移植，为转基因克隆动物的研究奠定了基础。     

转LacZ基因骨髓间充质干细胞体内造血分化的初步研究

目的　初步探讨小鼠骨髓间充质干细胞在体内造血细胞分化的潜能。方法　利用转LacZ基因小鼠MSCs输注X射线亚致死量照射的BALB/C小鼠,2个月后取骨髓细胞作体外甲基纤维素培养和X -Gal染色,取肝脏X -Gal染色。结果　MSCs输注组和对照组骨髓细胞体外集落培养均能形成鹅卵石样造血细胞集落,经X -gal组化染色后,输注组部分造血集落产生蓝绿色,对照组没有颜色变化。肝脏X -Gal染色输注组部分产生蓝色,对照组没有颜色变化。结论　小鼠MSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

两种条件培养基促进鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞

目的:从鼠胚胎干细胞获得具有造血重建功能的造血干细胞.方法:将ES-D3细胞形成4天拟胚体(4dEBs),再用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)和/或胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)诱导4dEBs生成造血干细胞.实验为mBMEC-CM FLSC-CM组、mBMEC-CM组、FLSC-CM组,对照组.检测诱导生成的细胞造血干细胞特异抗原表达、造血相关基因表达、造血集落的形成以及造血重建能力.结果:从诱导ES-D3细胞生成造血干/祖细胞的数量和生成的集落总数看,mBMEC-CM FLSC-CM组诱导效率显著高于其他3组.mBMEC-CM FLSC-CM组诱导生成的细胞能重建照射鼠的造血系统.结论:骨髓内皮细胞条件培养液联合胎肝基质细胞条件培养液可促进鼠胚胎干细胞分化为具有造血重建能力的造血干细胞.     

LMO4的异位表达对NB4细胞增殖和分化的影响

目的 探讨LMO4 对急性早幼粒白血病细胞系NB4细胞增殖和分化的影响. 方法 利用 qRT-PCR和 Western blot法检测 NB4 中 LMO4 表达;利用慢病毒介导 LMO4 的cDNA感染NB4 细胞后,建立过量表达 LMO4 的 NB4 细胞株;采用MTT法检测细胞增殖;使用全反式维甲酸( ATRA)诱导NB4细胞分化0 ~48 h,瑞氏染色观察分化的细胞特性;流式细胞术分析NB4 细胞分化后产生CD11b阳性的细胞比例. 结果 qRT-PCR 和 Western blot 结果均提示 NB4中LMO4表达增加;ATRA诱导NB4分化时,LMO4的表达降低;MTT结果证实过量表达LMO4促进NB4增殖;瑞氏染色和流式细胞术结果均显示,过量表达LMO4能够促进ATRA诱导NB4细胞分化. 结论 LMO4参与调节NB4细胞的增殖,并能增加NB4细胞对ATRA的敏感性,促进其分化.     

siRNA沉默LMO4基因对人胆囊癌OCUG细胞系生长的影响

目的 LIM-onlyfactor4(LMO4)作为哺乳动物LMO蛋白家族成员之一,是调节细胞增殖的重要转录调节因子,其在哺乳动物正常发育和肿瘤的形成过程中起着重要的调控作用。LMO4高表达于上皮-间质相互作用活跃的区域,肿瘤发生的机制与其表达的失调呈正相关趋势。探讨靶向LMO4的si RNA抑制LMO4基因对人胆囊癌OCUG细胞系生长的影响。方法采用si RNA降低LMO4基因的表达观察对OCUG细胞系的增殖、凋亡的影响。RT-PCR和Western blot检测转染si RNA后LMO4在OCUG细胞系的表达。cck-8细胞计数及集落形成实验检测转染si RNA后OCUG细胞系细胞增殖的速度变化。结果 RT-PCR和Western blot检测的结果显示,转染si RNA后能够有效抑制LMO4在胆囊癌OCUG细胞系的表达。cck-8细胞计数及集落形成实验证明,转染si RNA后能够有效抑制胆囊癌OCUG细胞系细胞增殖的速度。结论 LMO4在OCUG细胞系和肿瘤组织中高表达,并与细胞增殖相关。LMO4可作为胆囊癌的一种很有效的生物标志物和治疗目标。