基于单纯型设计和部件搜索方法的CHO细胞无血清培养基的高通量优化

氨基酸的浓度与配比对细胞生长和产物表达有重要作用。在自主研发无血清培养基的基础上,通过单纯型格子实验设计优化氨基酸浓度及配比后发现,优化的无血清培养基明显促进了细胞生长。生物反应器批式培养中,最高活细胞密度达52.6×105 cells·mL-1,抗体融合蛋白产量52.2 mg·L-1,相对于商业培养基Ex-cell 302,分别提高了26.7%和11.5%。在此基础上,通过部件搜索的方法确认具有显著正影响的氨基酸为谷氨酰胺、脯氨酸和甲硫氨酸。基于上述研究工作,在2 L反应器采用自主研发的优化无血清培养基,以葡萄糖为关键控制参数,进行两阶段动态流加培养过程,CHO细胞最大活细胞密度达94.6×105 cells·mL-1,抗体融合蛋白终产量600 mg·L-1,相对于商业培养基Ex-cell 302批式培养,分别提高了2.75倍和11.8倍。本研究工作为抗体融合蛋白的高效工业化生产奠定了基础。     

无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞的比较

目的对无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞进行比较。方法应用两种培养基采用小方瓶培养CHO细胞,观察细胞维持时间、培养过程的形态变化及对血凝效价的影响。结果应用无血清培养基(A)培养CHO-C28细胞虽然可维持细胞正常生长,但贴壁不好,逐渐降低(A)加量情况可得到相应改善。结论 目前无血清培养基尚不能完全取代含血清培养基用于培养CHO细胞。     

Plackett-Burman与响应面法相结合优化化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基

目的采用Plackett-Burman与响应面法相结合优化化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基。方法在自主研发的含蛋白无血清培养基的基础上,通过Plackett-Burman试验和响应面试验设计考察23组营养物质对MDCK细胞生长的影响,以细胞比生长速率、维持时间及最大活细胞密度作为响应值进行筛选和定量优化。以最优化的因子浓度配制化学成分明确的无血清无蛋白培养基,分别于细胞培养板和搅拌瓶中培养MDCK细胞,考察细胞比生长速率、维持时间和最大活细胞密度3个响应值的大小。结果通过Plackett-Burman试验筛选出4种对MDCK细胞生长具有显著性促进作用的因子:半胱氨酸、苏氨酸、亮氨酸和葡萄糖,苏氨酸和亮氨酸有助于提高细胞比生长速率,半胱氨酸和葡萄糖有利于提高最大活细胞密度;该化学成分明确的无血清无蛋白培养基能很好地支持MDCK细胞悬浮生长,单细胞悬浮培养MDCK细胞时,细胞比生长速率可达0.058/h,最大活细胞密度可达32.65×105个/ml,分别比基础培养基提高了2.15和3.09倍。结论采用Plackett-Burman与响应面法相结合优化了化学成分明确的MDCK细胞无血清无蛋白培养基,为采用MDCK细胞大规模工业化生产流感疫苗奠定了基础。     

表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养

目的优化表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重组CHO细胞的无血清培养基,并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化,建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白(<10mg/L)培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞,通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果 SFMC与原培养基SFMB相比,使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%,HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中,灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg/(L·d),较分批和流加培养的0.30mg/(L·d)提高了约133%。结论通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培养,可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。     

酵母浸出物FP103对CHO细胞生长的影响

目的探讨安琪酵母浸出物FP103对CHO细胞生长的影响。方法分别采用含3、1、0.125 g/L酵母浸出物FP103的DMEM/F12培养基(含1%FBS)培养CHO细胞,CCK-8法检测细胞生长情况。另将酵母浸出物FP103与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)联合加入DMEM/F12培养基(含0.5%FBS)中,用其培养CHO细胞,CCK-8法检测细胞生长情况,显微镜下观察CHO细胞形态。结果 1 g/L的酵母浸出物FP103可明显促进CHO细胞的生长(P 0.05)。酵母浸出物FP103与EGF联用可有效促进CHO细胞在低血清浓度下正常生长,且细胞形态正常,未见细胞悬浮不贴壁现象。结论酵母浸出物FP103可替代部分血清,为CHO细胞的生长提供所需营养。     

细胞生长、葡萄糖代谢及副产物重新利用对法夫酵母虾青素合成的影响分析

以两株产虾青素法夫酵母菌株为研究对象,分别在不同摇床转速、初始葡萄糖浓度、乙醇的存在与否等培养条件下,考察葡萄糖浓度、添加乙醇及溶氧状况对法夫酵母细胞生长、代谢副产物产生的影响及其与虾青素合成之间的关系,进一步阐明法夫酵母虾青素合成的机理。实验结果表明:法夫酵母JMU-VDL668菌株的生长速率、葡萄糖代谢速率和乙醇积累量均高于法夫酵母JMU-MVP14菌株,但前者的虾青素合成速率却远低于后者;当发酵液中的葡萄糖含量降低时,酵母细胞对糖代谢副产物进行二次利用,导致有利于虾青素合成的情况出现,虾青素产量得到进一步提高;在初始培养基中添加1 g?L?1乙醇能够在一定程度上促进虾青素的合成。     

葡萄糖及其代谢产物对犬肾上皮-siat7e细胞生长代谢的影响

目的探讨葡萄糖及其代谢产物对转染siat7e基因的犬肾上皮(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞(MDCKsiat7e)生长代谢的影响。方法采用含不同起始量(3. 86、6. 46、9. 29、10. 60、12. 80、16. 06 g/L)和维持量(3、5、7 g/L)葡萄糖浓度的无血清无蛋白培养基cellhappy BD001(简称BD001),分别分批培养MDCK-siat7e细胞,每24 h取样进行活细胞计数及葡萄糖、乳酸、氨含量测定。结果不同起始及维持量葡萄糖浓度的BD001对MDCK-siat7e细胞生长均无明显影响,细胞比生长速率以及乳酸、氨比生成速率和乳酸、氨含量差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论葡萄糖并不是制约MDCK-siat7e细胞生长的重要因素,起始葡萄糖浓度较低时,细胞生长后期可能利用代谢副产物乳酸维持生长,而起始葡萄糖浓度较高时,代谢副产物乳酸则有可能抑制细胞的生长,氨对细胞的生长具有明显的抑制作用。     

抗rhTNFα杂交瘤细胞的体外培养及抗体分泌的研究

采用非CO2依赖培养基（CO2-IM）在无CO2、37℃条件下培养抗rhTNFα杂交瘤细胞，培养1周PH无显著变化，细胞生长趋势和抗体分泌显著超过DMEM。将CO2－IM与SFPF－HM混合后添加ITSE可以培养抗rhTNF杂交瘤细胞，其细胞生长速率、密度、活力和抗体产量均达到或超过含血清培养。     

培养基组成成分对加利利链霉菌AF1发酵过程影响的初步探索

探索影响加利利链霉菌AF1发酵过程的培养基组成成分。碳、氮源试验结果表明菌株AF1能够较好的利用可溶性淀粉和胰蛋白胨。在基础培养基和培养条件不变的前提下,改变可溶性淀粉质量浓度,在质量浓度为3.5%时,菌株AF1的代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最高,达到15.5 mm。在基础培养基和培养条件不变的前提下,改变胰蛋白的质量浓度,当浓度达到0.25%时,抑菌活性最高,达到13.4 mm。供试的8种氨基酸试验结果表明Arg、Gln和Lys具有明显促进菌体生长的作用,Asn、Phe的促进作用不明显,而其他的氨基酸则表现出对菌体生长无显著效果;在产物合成方面,Arg、Asn、Phe、Tyr、Gln、Lys对产物合成具有较为明显的促进作用,但Met和Cys却表现出对产物合成有抑制作用。不同浓度的各种氨基酸试验结果表明,当基础培养基中Tyr浓度为0.13 mmol/L或者Lys 0.25 mmol/L时菌株生长和活性物质的代谢效果最为明显,100 mL的发酵液中菌体干重和发酵液抑菌活性分别达到0.19 g、14 mm和0.22 g、15.9 mm。     

生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞工艺的建立

目的建立无血清无蛋白无动物源性培养基BD001悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为MDCK-siat7e细胞的生物反应器规模化培养及病毒性疫苗的研制提供依据。方法采用BD001驯化MDCK-siat7e细胞,建立无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库,对细胞库进行常规检定,观察MDCK-siat7e细胞的生长形态;比较不同起始接种密度(4.0×10~5、8.0×10~5、1.6×10~6 cells/ml)悬浮培养,MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间、平台期细胞密度及活率;比较不同规模生物反应器(3、15、60 L)无血清无蛋白无动物源性培养MDCK-siat7e细胞对数生长期的比生长速率(μ)、分裂次数(Cd)、葡萄糖比消耗速率(q_(gluc))、乳酸对葡萄糖的转化率(Y_(lac)/g_(luc)),观察细胞的生长和代谢情况。结果建立的无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库复苏后细胞平均活率为(96.20±2.95)%。MDCK-siat7e细胞在BD001培养基中复苏传代后生长状态良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第6天进入平台期,第8天达最大细胞密度(6.2×10~6 cells/ml),维持至第12天细胞密度和活率开始下降,进入衰亡期。MDCK-siat7e细胞在无血清培养基中生长良好;不同起始接种密度MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间差异有统计学意义(P0.05),平台期细胞密度及活率差异无统计学意义(P0.05);不同规模生物反应器培养的MDCK-siat7e细胞的μ、Cd、q_(gluc)、Y_(lac/gluc)差异均无统计学意义(P0.05),细胞生长代谢良好。结论建立了生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为病毒性疫苗生产中采用无血清无蛋白、无动物源性培养基,生物反应器规模化培养MDCK-siat7e细胞提供了一定的实验依据。